基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法

摘要

基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，设计2对或3对引物，相邻片段引物的末端含有15bp重叠序列，外引物末端含有酶切位点，利用所设计的引物，加入含有所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，进行平行的完整PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物，取含有目的片段PCR产物为模板，加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行二次PCR反应，得到所需融合的目的基因。本发明解决了常规SOE‑PCR重叠引物较长，会导致退火温度过高和引物合成时不必要的浪费，有时PCR产物电泳没有条带，也容易产生弥散带、非特异性条带的问题，具有操作简单、快捷、高效的特点。

主权项

基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、根据所需融合的DNA片段序列设计两对或三对引物，在对应突变、缺失、插入和重组位点的两个相邻引物5＇末端设计一个长度为15bp的重叠区段，3＇末端为引物与模板特异性结合序列，然后利用设计的引物，以含有所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，分别进行平行的PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物；二、若步骤一的PCR产物为单一目的条带，则取两组或三组未纯化的PCR产物1～2μl进行混合，以混合的PCR产物为模板，然后加入所需融合的目的基因的一对外侧引物各1μl，采用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR反应，通过DNA片段重叠末端的延伸使两个或三个DNA片段连接成所需融合的目的基因片段，即完成所述的获取方法。