主权项 |
一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞培养的方法,其特征在于,其操作步骤为:(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死,用75%酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢卵泡,再用PBS冲去血污,将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中,迅速转移至细胞培养室中;(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出,剥净外层的结缔组织和血管网,在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污后,置于含有PBS的培养皿中;(3)将剥离好的卵泡,在卵泡柄对面的无血管区切开,稍微用力挤出卵黄成分,颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面,再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中;(4)将初次分离的颗粒细胞置于37℃预热的PBS培养皿中清洗5次,洗净卵黄;(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中并加入2mL胶原蛋白酶,用眼科剪剪成小块组织,机械分离持续5min,再将其封口后,置于37℃水浴消化4min;(6)向消化完全的颗粒细胞中加入适量胎牛血清,终止消化;(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤,并用少量细胞培养液冲洗过滤网,将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rpm离心10min,弃上清,再加入培养缓冲液悬浮细胞,重复此过程一次;(8)加入含有胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞使细胞悬浮,稀释细胞时细胞密度维持在1×10<sup>6</sup>个,将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养,每孔2mL;(9)用75%的酒精棉将培养板擦拭干净后,置于培养箱恒温培养,培养箱条件为37℃,5%的CO<sub>2</sub>;上述步骤中所述PBS缓冲液是:在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl,0.2g的KCl,1.56g的Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O,0.2g的KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>,溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2~7.4,用去离子水定容至1L,121℃,100kpa灭菌30min;上述步骤中所述的含有胎牛血清的DMEM培养液是含3%胎牛血清的DMEM;上述步骤中所述的胶原蛋白酶是100mg的胶原蛋白酶稀释于100mL的水中,其终浓度为1mg/mL。 |