一种利用常规试剂提取RNA的方法

摘要

本发明涉及一种利用常规试剂提取RNA的方法，是在常规沉淀获取RNA的基础上进行改良，包括混合试剂配制、待提取物准备、RNA提取液配制和RNA分时间段提取，提取过程采用常规试剂，费用低，适合大批量植物样品中RNA的提取；将RNA提取的过程分段进行，解决了由于RNA样品数目过大、工作量繁重、难以保证提取的RNA质量的问题，RNA产出率大、RNA不易污染降解、质量高，能够保证后续实验对RNA产量和质量的要求。

主权项

一种利用常规试剂提取RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)试剂配制：0.1％DEPC水的配制：将1mL DEPC原液加入到999mL双蒸水中，涡旋混合8～12h后，灭菌备用；1M Tris/HCl溶液的配制：取Tris溶于0.1％DEPC水中，利用盐酸调节PH值到8.0，用0.1％DEPC水定容，高温高压灭菌备用；4M LiCl溶液的配制：取LiCl溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容，高温高压灭菌备用；10％SDS溶液的配制：取SDS溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容，高温高压灭菌备用；0.5M Na₂EDTA溶液的配制：取Na₂EDTA溶于0.1％DEPC水中，用NaOH调节溶液pH值至8.0，用0.1％DEPC水定容，高温高压灭菌备用；3M醋酸钠溶液的配制：取醋酸钠溶于0.1％DEPC水中，冰醋酸调节PH到5.2，用0.1％DEPC水定容，高温高压灭菌备用；(2)混合试剂配制：取1M Tris/HCl溶液、4M LiCl溶液、10％SDS溶液和0.5M Na₂EDTA溶液加入容量瓶中，盐酸调节pH至8.0，并用0.1％DEPC水定容，配制成混合试剂，灭菌备用，所述的混合试剂中Tris的浓度为0.1M、LiCl的浓度为0.4M、SDS的浓度为1％、Na₂EDTA的浓度为10mM；(3)待提取物准备：取待提取的鲜嫩植物组织样品置于装有液氮的冷研钵中，液氮保护下快速将组织样品研磨成组织粉末；将研磨好的组织粉末迅速转移至提前预冷的离心管中，‑80℃贮藏备用；(4)RNA提取：将步骤(3)贮藏的装有组织粉末的离心管转移到液氮中；将步骤(2)配制的混合试剂和PH<7的水饱和酚按照1:1的比例混合为RNA提取液，在80℃水浴中预热；吸取1体积份RNA提取液迅速加入到装有组织粉末的离心管中，充分震荡至组织粉末充分溶解，继续涡旋震荡30秒后，加入0.5体积份氯仿‑异戊醇混合液，继续涡旋震荡30秒；然后在4℃温度下离心5min，上层水相转移到另一个离心管中，加入同等体积的氯仿‑异戊醇混合液，继续涡旋震荡30秒，再在4℃温度下离心5min，上层水相转移到另一个离心管中，加入同等体积浓度为4M的LiCl溶液，充分上下颠倒混匀后在4℃温度下温育8～12h；取出温育的样品，在4℃温度下离心20min，弃去上清液，加入1mL 70％的酒精，离心5mim漂洗沉淀，弃去上清液，在通风橱中晾干；加入0.15体积份DNA酶处理液，冰浴15～30min使沉淀溶解，然后37℃水浴30min，加入0.15体积份0.1％DEPC水，再加入等体积PH<5.0的苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液，涡旋混匀，离心5min；将上清液转移到新的离心管中，加入等体积氯仿‑异戊醇混合液，涡旋混匀，离心5min；将上清液转移到新的离心管中，再加入0.1体积份PH为5.2的3M醋酸钠溶液和2.5体积份无水乙醇，将处理好的离心管‑20℃冰箱中放置8～12h或在‑80℃冰箱中放置至少1h；取出冰箱中的样品在4℃温度下离心20min，弃去上清液，加入1体积份70％的酒精，离心5mim漂洗沉淀，弃去上清液，通风橱充分晾干；加入0.02～0.05体积份0.1％DEPC水，冰浴或37℃水浴使沉淀溶解，然后在4℃温度下离心5min，转移上清液到新的离心管中，即为RNA样品液，在‑80℃温度下保存；所述的氯仿‑异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；所述的苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1。