一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法，涉及天然产物分析领域。本方法是：①酶结合反应缓冲液的配制；②待测样品的配制；③标准溶液的配制；④待测样品与正常和失活拓扑异构酶I的结合反应；⑤反应样品的色谱‑质谱检测分析；⑥拓扑异构酶I对抑制剂的富集率。本发明将超滤膜技术与色谱、质谱联用技术联用方法应用到拓扑异构酶I抑制剂的筛选中，样品分析速度快、特异性强，可方便地识别与生物靶分子相结合的药物配体；同时样品分析用量少、谱图信息量大，可实现先导化合物的快速筛选，在药物小分子配体和生物大分子受体相互作用研究方面具有很大的优势；适用于分析天然产物提取物或者单体化合物对拓扑异构酶I体外富集率。

主权项

一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：所述的超滤质谱联用技术是指一种将超滤膜技术与色谱、质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段；所述的拓扑异构酶I抑制剂是天然产物提取物或其单体化合物；本发明优选天然产物鼠李提取物、石蒜生物碱提取物、单体化合物重楼皂苷I、II、VI和VII；①酶结合反应缓冲液的配制（1）酶结合反应缓冲液包括：醋酸钾：50 毫摩尔/升，三羟甲基氨基甲烷‑醋酸：20毫摩尔/升，醋酸镁：10毫摩尔/升，二硫苏糖醇：1毫摩尔/升；精确称取醋酸钾4907毫克、三羟甲基氨基甲烷‑醋酸2422.8毫克、醋酸镁2144.6毫克和二硫苏糖醇154.3毫克，使用去离子水溶解至终体积为1升，充分混合后，25℃下pH值为7.9；②待测样品的配制（2）精确称取适量待测样品，用酶结合反应缓冲液充分溶解，待测液终浓度为1.0‑3.0毫克/毫升；所述的待测样品是鼠李提取物或石蒜生物碱提取物；③标准溶液的配制（3）用乙腈将内标样品配制成浓度为100微克/毫升的标准母液，进行质谱检测前加入至待测样品液中，终浓度为2.0‑5.0微克/毫升；所述的标准品为异夏佛塔苷或荷叶碱；④待测样品与正常和失活拓扑异构酶I的结合反应（4）实验组：在0.2 毫升的离心管中依次加入100 微升的待测样品液与10 微升浓度为0.5 U/微升的DNA拓扑异构酶I，37℃下孵育30分钟；将反应混合液转移至截留分子质量为3万道尔顿的超滤管中，在10000 转/分钟下离心10分钟；加入200微升缓冲液洗去未结合成分，并再次在10000转/分钟下离心10分钟；重复上述步骤2次，合并滤液；向超滤管中加入200微升的90%乙腈，室温下放置10分钟后，10000 转/分钟下离心10分钟，释放配体；重复上述步骤2次，合并滤液；将上述所得洗脱液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色谱‑质谱分析；对照组：在0.2 毫升的离心管中依次加入100 微升的待测样品液与10 微升于沸水中放置 10 分钟灭活的浓度为0.5 U/微升的DNA拓扑异构酶I，37℃下孵育30分钟；将反应混合液转移至截留分子质量为3万道尔顿的超滤管中，在10000 转/分钟下离心10分钟；加入200微升缓冲液洗去未结合成分，并再次在10000转/分钟下离心10分钟；重复上述步骤2次，合并滤液；向超滤管中加入200微升的90%乙腈，室温下放置10分钟后，10000 转/分钟下离心10分钟，释放配体；重复上述步骤2次，合并滤液；将上述所得洗脱液吹干并加入50微升的90%乙腈溶解，用于色谱‑质谱分析；⑤反应样品的色谱‑质谱检测分析（5）以内标法定量，对步骤④中两组样品溶液进行高效液相和质谱检测；根据色谱图中各峰的峰面积与内标样品的峰面积比，计算各成分相对浓度；对提取物待测样品、实验组和对照组样品进行高效液相色谱和质谱检测；⑥拓扑异构酶I对抑制剂的富集率（6）拓扑异构酶I对拓扑异构酶I抑制剂的富集率，可通过酶作用前后待测样品中各个色谱峰曲线下截面积的变化进行计算评价；分别根据未处理待测样品、与拓扑异构酶I作用前后的实验组、对照组中各个色谱峰曲线下截面积，依据如下公式计算拓扑异构酶I对拓扑异构酶I抑制剂的富集率：EF=（A_实验‑A_对照）/A_待测×100%式中，EF为拓扑异构酶对I抑制剂的富集率，A_实验为样品与拓扑异构酶I作用后色谱峰的截面积，A_对照为样品与灭活拓扑异构酶I作用后色谱峰的截面积，A_待测为未与拓扑异构酶I发生作用的待测样品中色谱峰的截面积。