主权项 |
一种雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一:以野生两年雷公藤幼苗经室温二次栽培以后的新生根系为外植体,在MS培养基上培养愈伤组织,培养条件为:光照强度为1500lx‑2500lx,温度25±1℃,18‑25天形成愈伤组织;步骤二:将成熟质地疏松的愈伤组织投入6,7‑V培养基中,接种量为5g,置于转速为120r/min摇床上,振荡培养18天,18天继代一次,连续继代5‑8代,即得雷公藤悬浮细胞液;步骤三:调节所述雷公藤悬浮细胞液的pH至5.0,按照每200ml,10g的接种量,加入诱导子,在25℃、振荡速度为120r/min的摇瓶振荡培养18天;此后每隔3天检测反应体系的pH值使pH保持在5.0,当反应体系中的雷公藤甲素及其衍生物的总含量低于0.0001mg/L后,停止震荡培养,过滤除菌后取上清液,将上清液于8000r/min,离心10min去除沉淀;步骤四:将经过步骤三处理所得的上清液与等体积石油醚充分混合,于分液漏斗中静置至分层,弃去石油醚层,再用相对于所述上清液1/2体积的乙酸乙酯萃取3次,过中性氧化铝层析柱脱去色素,再用体积比为4:1的石油醚‑乙酸乙酯20ml淋洗,然后用体积比为4:1的石油醚‑乙酸乙酯60ml冲洗柱子,收集洗脱液;用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干,加3ml色谱纯甲醇溶解,过0.22μm微孔滤膜,即得产品;所述步骤三中的诱导子为:A1:C1=1:1、A9:C6=5:3、A1:D1=1:1、A1:B1:C1=1:1:1、A1:B1:C1=2:3:1、A1:B1:C1:=1:2:3、A3:B10:C6=1:3:1、A4:B6:C9=2:3:1、A8:B1:C6=3:1:4、A1:B1:D1=1:1:1、A1:B1:D1=3:1:3、A1:B1:D1=2:3:4、A4:B6:D3=3:1:3、A6:B1:D10=4:7:1、A1:C1:D1=1:1:1、A1:C1:D1=5:1:3、A1:C1:D1=1:2:2、A10:C11:D3=1:6:2、B1:C1:D1=1:1:1、B1:C1:D1=5:1:3、B1:C1:D1=1:2:2、B10:C11:D3=1:6:2、A1:B1:C1:D1=1:1:1:1、A1:B1:C1:D1=5:1:10:5、A1:B1:C1:D1=1:2:5:3、A6:B9:C3:D2=1:5:2:1、A3:B6:C5:D9=1:8:3:4、B1:C1=1:1、B3:C9=3:5或B1:D10=1:30;其中,上述各成分之间的配比均为摩尔比;所述A1为α‑环糊精,A3为2,6‑二甲基‑β‑环糊精,A4为2‑羟丙基‑β‑环糊精,A6为羟乙基‑β‑环糊精,A8为磺丁基‑β‑环糊精,A9为γ‑环状糊精,A10为羧甲基‑β‑环糊精;B1为酵母抽提物,B3为大豆褐杆病菌,B6为腐霉菌,B9为根腐霉诱导子,B10为大豆褐杆病菌;C1为茉莉酸甲酯,C3为壳聚糖,C5为真菌聚糖类,C6为β‑葡聚糖,C9为油菜素内酯,C11为甲壳素;D1为硫酸铜,D2为氯化镉,D3为Ag<sup>+</sup>,D9为Zn<sup>2+</sup>,D10为Hg<sup>2+</sup>;所述雷公藤甲素及其衍生物具体为:雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素。 |