主权项 |
一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法,其特征在于包括以下步骤:步骤一:取人体的静脉血存于‑80℃冰箱中待检测;步骤二:血清MICA蛋白含量的检测采用western blot法a. 3ml静脉全血离心后提取血清1ml,用ELISA法进行蛋白定量,PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合;b.将上述准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样,进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白;c.蛋白质转移到PVDF膜,按Bio‑Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4℃转移过夜;d. PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合蛋白,封闭过的膜加入抗MICA一抗,室温孵育1.5小时,抗原抗体结合,加入HRP标记的二抗,室温孵育膜1小时;e. PVDF膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影,图片扫描保存为电脑文件;步骤三:血清MICA mRNA表达水平的检测a.提取RNA:3ml静脉全血离心后提取血清1ml;b.逆转录合成cDNA第1链及第2链;c.将逆转录合成的cDNA进行PCR扩增:在50ul的反应体系中加入1ul上述cDNA、2.5ul Taq酶和2.5ul抗Taq酶,5’端引物序列为ATGCCCCAGTCCTCCAGA,3’端引物为GTGGCATCCCTGTGGTCA,内参基因选择为beta‑actin,PCR周期设置为94℃变性1分钟,64℃复性1分钟,聚合过程45秒,进行30个周期的扩增;采用BigDye Terminator Cycle sequencing kit and Abi Prism 310试剂盒测定扩增的DNA产物,与内参基因对比的水平即MICAmRNA的表达水平。 |