一种干旱区果树作物基因组DNA的提取方法

摘要

本发明涉及一种干旱区果树作物基因组DNA的提取方法，该方法从干旱区果树植物叶片组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的果树植物叶片组织中通过液氮研磨，转入离心管中，加入提取缓冲液，在水浴锅中温浴，离心，吸取上清液，将上清液转入另外两个新的离心管中，分别加入氯仿和异戊醇，离心，再吸取上清液，合并上清液，转入另一个新的离心管中，加入氯仿和异戊醇，离心，再次吸取上清液，将上清液转入另一个新的离心管中，加入冷冻无水乙醇，放入冰箱，离心，有清晰乳白色的DNA白絮沉淀，用乙醇洗涤，自然风干后，溶于缓冲溶液中，冰箱保存即可获得了高质量的果树基因组DNA，通过本发明所述的方法能够用于后续的PCR扩增及分子克隆等实验。为进一步的分子生物学技术在干旱区果树上的运用奠定了基础。

主权项

一种干旱区果树作物基因组DNA的提取方法，其特征在于按下列步骤进行：a、称取果树材料如苹果，梨，杏，桃，枣，核桃，扁桃，开心果的叶片，置于经预冷、灭菌后的研钵中，加入液氮研磨至粉末，转入1500μL离心管中；b、迅速加入1000μL，温度65℃预热的含2%十六烷基三甲基溴化铵，1.4M氯化钠，20mM四乙酸二氨基乙烯，100 mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0的缓冲液和8%巯基乙醇的缓冲液，轻轻摇匀；c、置于温度65℃水浴锅中温浴60 min，其间每隔10 min 轻轻上下晃动摇匀1次，使溶液充分裂解；d、采用台式离心机离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，吸取上清液，将上清液平均分配转入另外两个新的1500μL离心管中，其中每个离心管中均含有480μL上清液；e、将每个含有上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1，轻轻上下晃动摇匀，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，吸取上清液，将每个离心管中的上清液合并，转入另一个新的1500μL离心管中，其中离心管中含有600μL上清液；f、将装有600μL上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1，轻轻上下晃动摇匀，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15 min，再吸取上清液，将上清液转入另一个新的1500μL离心管中，其中离心管中含有400μL上清液；g、将装有400μL上清液的离心管中加入2倍体积的冷冻无水乙醇，放入温度‑20℃冷冻冰箱，时间30min，离心，温度21℃，转速10000 r/min，时间15min后有清晰乳白色的DNA白絮沉淀，去除上部液体；h、再将乳白色的DNA白絮沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤2‑3 次，自然风干后，溶于50μL 含有10 mM三羟甲基氨基甲烷，1mM四乙酸二氨基乙烯，pH8.0的缓冲溶液中，温度‑20℃冰箱保存。