半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法

摘要

本发明公开了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，属于分子生物技术领域。本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。

主权项

一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：小麦籽粒DNA的提取a.切取1/3～1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，离心；b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，离心；d.弃上清液，于室温下充分干燥；e.加双蒸水溶解DNA；步骤二：高分子量谷蛋白亚基的PCR反应5亚基的引物序列为：P₁5′‑GCCTAGCAACCTTCACAATC‑3′，P₂5′‑GAAACCTGCTGCGGACAAG‑3′；10亚基的引物序列为：P₃5′‑GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG‑3′，P₄5′‑TGGAGAAGTTGGATAGTACC‑3′；PCR反应体系为25μL，含1μL提取的DNA，1×Buffer，2mmol/L MgCl₂，每种dNTP各为0.8mmol/L，每种引物各为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s～1min，35个循环，最后72℃再延伸5min；步骤三：高分子量谷蛋白亚基的SDS‑PAGE电泳及检测选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液；高分子量谷蛋白亚基的检测：采用不连续SDS‑PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为8%，交联度为3.33%。