一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法

摘要

一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1）溶液的配制，2）细胞接种，3）电子烟烟液体染毒及BrdU掺入，4）BrdU掺入量的测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察电子烟烟液对肺部不同细胞系的细胞毒性。（3）通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。（4）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

主权项

一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：该方法是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度电子烟烟液染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，定量评价电子烟烟液的细胞增殖毒性，具体步骤如下：1）  溶液的制备：（1）不同浓度电子烟烟液染毒溶液：利用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；（2）pH为6.7的磷酸盐缓冲液PBS：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制；（3）封闭液：由PBS缓冲液配制质量百分比为1%的 BSA溶液作为封闭液；（4）HRP酶标记的BrdU抗体： ‑20 ℃保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制；（5）细胞固定液：4% 多聚甲醛或70%乙醇；（6）2M的盐酸HCl溶液：使用去离子水配制2M的HCl溶液；（7）细胞膜通透液：曲拉通100（Triton‑100），使用PBS溶液稀释配制；（8）0.1M四硼酸钠（Na₂B₄O₇）：用PBS溶液配制 ；（9）HRP酶显色底物：3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）溶液；（10）细胞培养基：溶剂为RPMI‑1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L‑谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；2）细胞样本的处理（1）细胞接种：向96孔板除最外周36个孔外分别接种100ul细胞悬液，于37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h；所使用细胞系为贴壁细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞CHO、人肺癌细胞A549或人肺正常上皮细胞BEAS‑2B细胞，CHO细胞和A549细胞的接种密度为10000个/孔，BEAS‑2B细胞的接种密度为20000个/孔；开展细胞毒性评价前，需对所用细胞株的适用性进行评价，细胞非特异性吸附的吸光度值应小于等于0.2；（2）电子烟烟液染毒及BrdU掺入：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板除最外周36孔外每列6孔为一组分别设置为空白对照组和电子烟烟液染毒组，空白对照组中每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组中每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，电子烟烟液染毒浓度覆盖10mg/ml‑100mg/ml的范围，设置不少于7个非零染毒浓度；96 孔板的最外周36 个孔中加入细胞培养基，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养22 h ，每孔加入10ul的BrdU染料，继续孵育；（3）BrdU掺入量的测定：a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100ul 的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20‑30分钟;b、吸除溶液后，每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；c、每孔加入100ul 2MHCl，室温下放置15分钟；d、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；e、每孔加入100ul 0.1M四硼酸钠（Na₂B₄O₇），室温下放置15分钟；f、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；g、每孔加入100ul的0.1%Triton 100溶液进行细胞膜通透，反应1‑2min；h、为减少抗体的非特异性吸附，每孔加入100ul的1%BSA中封闭1h，i、每孔加入100ul的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜；j、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值；（4）数据处理吸光值A ：A = A450 nmA_{空白对照组}=6个平行孔的吸光度平均值A_染毒组=6个平行孔的吸光度平均值细胞增殖抑制率（%）= 1‑A_染毒组/ A_{空白对照组}。