九种人肝CYP450酶体外抑制效应快速筛选方法

摘要

本发明公开了应用14种探针底物与16种探针反应全面评估9种人肝CYP450代谢酶体外抑制效应的快速筛选方法。本发明主要涉及采用体外混合探针孵育法与LC/MS/MS联用监测9种人肝CYP450酶的代谢活性变化，快速全面的评估受试化合物对代谢酶的抑制效应。该方法综合考虑了探针底物的专一性与多样性，探针底物之间的相互影响、温孵体系中不同孵育条件(有机溶剂、缓冲液、BSA的加入等)对探针反应的活性影响，以及16种探针反应在所选孵育条件下的酶动力学特征等各项因素，并结合高灵敏度、高选择性的LC-MS/MS技术，建立了一种全新的体外评估体系，以期在新药开发的高通量筛选中能更准确更全面的预测受试化合物对9种人肝主要代谢酶可能产生的抑制效应，提高后期代谢性相互作用的预见性。

主权项

建立了新型的九种人肝CYP450酶抑制效应的快速筛选方法，其特征包括以下几方面：a)所建立方法能够同时筛选九种主要CYP450酶亚型，即CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4的抑制效应。b)各亚型所选择的特异性探针底物为：CYP1A2特异性探针底物为非那西丁(1.0～100μM)；CYP2A6特异性探针底物为香豆素(0.1～2.3μM)；CYP2B6特异性探针底物为安非他酮(1.0～100μM)；CYP2C8特异性探针底物为紫杉醇(0.1～19μM)；CYP2C9特异性探针底物为甲苯磺丁脲(10～100μM)、双氯芬酸(1.0～52μM)；CYP2C19特异性探针底物为奥美拉唑(1.0～26μM)、S‑美芬妥英(0.1～35μM)；CYP2D6特异性探针底物为丁呋洛尔(1～15μM)、右美沙芬(0.1～8.5μM)；CYP2E1特异性探针底物为氯唑沙宗(10～100μM)；CYP3A4特异性探针底物为睾酮(10～94μM)、咪达唑仑(0.1～14μM)、尼非地平(0.1～47μM)、奥美拉唑(1.0～26μM)。c)结合缓冲液、有机溶剂、BSA等对酶活性的影响及底物相互作用等对所选各亚型探针底物作分组(如下表所示)孵育，再通过LC‑MS/MS同时检测多种代谢产物。