一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法

摘要

本发明公开了一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶，得到的酶制剂酶活力高、耐酸性好、耐热能力强，该制备方法发酵周期短、能耗少、水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大，具有极好的工业化应用前景。

主权项

一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30‑35℃培养箱培养3‑5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为10⁷个/mL，再接种所得孢子悬浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30‑40℃培养箱培养3‑4天，用生理盐水将孢子浓度稀释至1.2‑1.6×108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到100mL液体种子培养基，置于摇床30‑40℃培养1‑2d，摇床转速160‑250r/min；步骤2，深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固态培养基50g，35‑40℃培养2‑3d，将温度提高至40‑45℃继续培养2天，添加补料液体营养液10‑20mL，再将温度降至30‑37℃下培养7‑8d；步骤3，深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验，曲盘大小为36cm×20cm×6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1.2:l，初始pH5.5，33‑35℃下静止培养72h，期间翻曲3‑4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至35‑40℃，继续培养24h，中间翻曲2次,最后将温度降至28‑32℃，再培养24h，得粗酶液；步骤4，阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转蒸发，得粗酶浓缩液；步骤5，粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。