一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用

摘要

本发明公开一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs及其制备方法及应用。PCR扩增人源Nrf2基因ORF；纯化双酶切与骨架质粒pLV-CMV-XbaI-BamHI-GFP连接Nrf2慢病毒重组载体，转化后挑选克隆并确定阳性克隆；测序确定无突变后大量扩增；将重组载体及辅助质粒导入293FT细胞获得病毒；感染第3～5代hUC-MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2的细胞株MSCs。本发明通过在MSCs中稳定过表达Nrf2增加其细胞活力，兼具在缺氧及氧化应激条件下具有更强的抗凋亡特性；在体外获得治疗水平数量的Nrf2-MSCs，可作为临床前研究MSCs的良好工具细胞及制备增进临床前实验MSCs移植的药物。

主权项

一种过表达Nrf2基因的细胞株MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、PCR技术扩增人源Nrf2基因开放阅读框；(2)、将步骤(1)获得的PCR产物进行纯化，双酶切后与骨架质粒pLV‑CMV‑XbaI‑BamHI‑GFP连接，构建了Nrf2慢病毒重组载体；转化后挑选单克隆，摇菌，取菌液行PCR扩增确定阳性克隆；(3)、将阳性克隆进行测序，确定无突变后大量扩增；(4)、将步骤(2)获得的Nrf2慢病毒重组载体与辅助质粒按质量比10：5：5：5的比例共转染至293FT细胞，转染后分两次收获293FT细胞培养上清，将两次获得的上清混合，过滤上清，即获得病毒；所述的辅助质粒分别为pCMSCV、PMDG和PMOⅡ，它们与骨架质粒构成四质粒慢病毒包装系统；(5)、将步骤(4)获得的高滴度病毒感染第3～5代hUC‑MSCs细胞，获得稳定过表达Nrf2基因的细胞株MSCs。