禽网状内皮组织增生病病毒和J亚群禽白血病病毒快速联检试纸条

摘要

本发明公开一种一步法快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV和J亚群禽白血病病毒ALV-J的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成；纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗REV和抗ALV-J的抗体检测印迹；所述抗REV和抗ALV-J的抗体为抗REV和抗ALV-J的单克隆抗体或多克隆抗体；金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV和抗ALV-J的混合多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便，检测快速，结果直观，适用于REV和ALV-J病毒的现场快速联合检测，亦可用于两种病毒的单独感染或混合感染的鉴别诊断。该试纸条使用范围广，便于推广应用。

主权项

一种一步法快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV和J亚群禽白血病病毒ALV‑J的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于：所述纤维素膜层上标记有羊抗小鼠IgG或兔抗小鼠IgG的对照印迹，以及标记的REV抗体、ALV‑J抗体的检测印迹，所述REV抗体、ALV‑J抗体为抗REV、抗ALV‑J的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV和抗ALV‑J的多克隆抗体或单克隆抗体；所述胶体金标记的抗REV和抗ALV‑J的单克隆抗体是通过以下方法制备的：将筛选获得的抗REV和抗ALV‑J的单克隆细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个的细胞量分别对经产母鼠进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，分别获得抗REV和抗ALV‑J的单克隆抗体腹水；用柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5～2 %（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15～20nm的胶体金溶胶；以0.1 mol/L的K₂CO₃溶液调节胶体金溶胶的pH值至8.5～9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将抗REV和抗ALV‑J的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加20 %（wt）的PEG‑10000至PEG‑10000的终浓度为0.05 %（wt），4℃下、1500～3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，在4℃下、15000 r/min再次分别离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S‑400柱层析，分别分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗REV和抗ALV‑J的单克隆抗体；所述抗REV和抗ALV‑J的单克隆抗体细胞株是由以下方法分别制备的：分别用原核表达REV囊膜糖蛋白gp90的重组质粒PET‑28a‑gp90和原核表达ALV‑J囊膜糖蛋白gp85的重组质粒PET‑28a‑gp85转化大肠杆菌BL‑21，挑选阳性克隆菌株；摇菌培养后用IPTG诱导蛋白表达，菌液上清经超声波裂解后过镍柱纯化，分别得到纯化的REV gp90表达蛋白和ALV‑J gp85表达蛋白；将纯化的REV gp90表达蛋白和ALV‑J gp85表达蛋白分别以20～30μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠两组，每组免疫三次，每次间隔15～30 d；最后一次加强免疫后3～4 d，分别将两组免疫鼠眼球放血，拉颈处死后置于75%（v）的酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌摘取免疫鼠的脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将每组收集的免疫鼠的1×10⁸个脾细胞分别与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬稀释至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清，分别将两种混合细胞沉淀置于37℃水浴中，在1 min内分别缓缓加入0.7～1.0 mL pH值为8.5～9.0的PEG‑1500，边加边轻轻摇晃，然后再分别缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min，最后补足GNK洗液至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清；将两种细胞沉淀分别重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200 µL/孔分别铺板至96孔培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7~10 d，将杂交瘤的培养上清分别用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，分别用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后分别筛选获得特异性的抗REV和抗ALV‑J的单抗杂交瘤细胞株。