一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法

摘要

一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法属于一种基因突变的实时荧光定量检测方法。该方法将real-time PCR技术与ARMS技术结合，通过特殊的引物设计，大大降低了引物二聚体对检测过程的干扰，提高了检测的灵敏度和准确率。同时，采用SYBR GreenⅠ染料法可以降低检测的成本。

主权项

一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于共分两步：第一步：提取待测样品的基因组DNA；第二步：运用三对引物，包括一对通用引物、两对ARMS引物，进行三组实时荧光定量PCR反应；所述通用引物的序列为：上游引物：SEQ ID NO:15’CAG AAG GAA GAG AAT ACT TG3’下游引物：SEQ ID NO:25’TCG AGC AGT TGA GAA TAG TG3’所述第一对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ ID NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ ID NO:35’GAG CAG TTG AGA ATA GTG CG3’SEQ ID NO:45’GAG CAG TTG AGA ATA GTG AG3’SEQ ID NO:55’GAG CAG TTG AGA ATA GTC AG3’SEQ ID NO:65’GAG CAG TTG AGA ATA GTT AG3’SEQ ID NO:75’GAG CAG TTG AGA ATA GCG AG3’SEQ ID NO:85’GAG CAG TTG AGA ATA GAC TG3’所述第二对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ ID NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ ID NO:95’GAG CAG TTG AGA ATA GTG CA3’SEQ ID NO:105’GAG CAG TTG AGAATA GTGGA3’SEQ ID NO:115’GAG CAG TTG AGA ATA GTCTA3’SEQ ID NO:125’GAG CAG TTG AGA ATA GAG TA3’SEQ ID NO:135’GAG CAG TTG AGA ATA GACTA3’PCR反应体系的配制及扩增程序：⑴通用引物的扩增：反应混合液的配制：将浓度为5mM的通用引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入上述PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑵第一对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第一对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑶第二对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第二对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；根据三组反应的循环阈值即Ct值，即可准确鉴定待测菌株是野生型还是H272Y突变型；上述PCR反应体系的配制及扩增程序中采用的dNTP均包括A,T,C,G四种核苷酸，四种核苷酸的浓度分别为6mM。