一种测定配方奶粉中低聚半乳糖含量的检测方法

摘要

本方法涉及低聚半乳糖含量的检测方法，尤其涉及气相色谱-质谱测定配方奶粉中低聚半乳糖含量的检测方法。用热的磷酸盐缓冲液从待测样品中提取低聚半乳糖和乳糖，用β-半乳糖苷酶将提取液中的低聚半乳糖水解，离心，取上清液过微孔滤膜，氮气吹干或低温真空干燥后，BSTFA衍生，用丙酮定容。采用气相-质谱联用法分别测定提取原液中游离的半乳糖和乳糖，和酶解分解液中低聚半乳糖和乳糖释放出的半乳糖总量，用酶解分解液后的半乳糖含量减去提取原液的半乳糖含量和乳糖酶解产生的半乳糖含量，计算出样品中低聚半乳糖的含量。采用本发明的方法检测奶粉中低聚半乳糖的含量，具有检测限低、灵敏度高的优点。

主权项

一种测定配方奶粉中低聚半乳糖含量的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)提取：称取均匀样品1.0g(精确至0.01g)于50mL刻度塑料离心管中，加入40mL磷酸盐缓冲液(0.2M磷酸盐缓冲液：22.0g磷酸二氢钾+6.0g磷酸氢二钾+1.0L二级水)溶解，涡旋混匀，在80℃±2℃水浴中持续振摇提取30min，冷却至室温后用磷酸盐缓冲溶液定容至100mL，移取5.0mL试样的提取溶液于50mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液定容至50mL，备用。(2)酶解：移取提取液1.0mL于10mL刻度塑料离心管中，加入0.5mLβ‑半乳糖苷酶溶液(来源于米曲霉，50U/mL)，混匀，在60℃±2℃水浴中持续振摇60min，冷却至室温后用20％乙腈定容至10mL，摇匀，10000r/min离心10min，上层水相用滤纸过滤，用0.22μm水相滤膜过滤，待衍生，测定并计算酶解后半乳糖的浓度(C₁)。(3)酶解前：同时移取提取液1.0mL于10mL刻度塑料离心管中，加入0.5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀，在60℃±2℃水浴中持续振摇60min，冷却至室温后用20％乙腈定容至10mL，摇匀，10000r/min离心10min，上层水相用滤纸过滤，然后用0.22μm水相滤膜过滤，待衍生，测定并计算提取原液中游离乳糖的浓度(C₂)和游离半乳糖的浓度(C₃)。(4)衍生：分别移取(2)和(3)的最终样液1mL，氮气吹干或低温(50～60℃)真空干燥后，分别加入400μL N，N‑二甲基甲酰胺(DMF)和200μL衍生试剂(N，O‑双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的混合液(比例为99∶1，v/v)，保证密封并震荡混匀，75℃±2℃衍生30min，冷却后，用丙酮定容至1mL，过0.22μm有机膜。(5)测定：定容后的溶液进入气相色谱‑质谱仪，选择离子扫描检测(SIM)，外标法定量；(6)采用气相色谱‑质谱仪，配电子轰击源(EI)；作为优选，气相色谱‑质谱条件：色谱柱：DB‑5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)或相当柱；进样口：280℃；传输线温度：280℃；氦气流速为1.0mL/min；进样方式：分流，分流比20∶1；进样量1μL；柱温：150℃；升温程序：从150℃以4℃/min升温至230℃，以20℃/min升温至280℃(保持15min)；载气：氦气；流速：1.0mL/min(恒流)；电离方式：EI；电离能量：70eV；测定方式：SIM；溶剂延迟：5min；离子源温度：230℃；并根据保留时间定性，半乳糖和乳糖的衍生物的定性离子皆为m/z 191和m/z 217，以m/z 204为定量离子。(7)计算公式：样品中低聚半乳糖含量X按公式(a)计算，数值以mg/100g表示。式中：X——样品中低聚半乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；1.35——折算系数因子；注：1.35为低聚半乳糖原料的经验k值，不同的产品可能会有不同，可通过实际添加的低聚半乳糖原料实测的k值作为计算值。G_t——酶解分解液中最终的半乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；L_b——提取液原液中的乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；1.9——乳糖换算成半乳糖的经验换算系数；G_b——提取原液中的半乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)。公式(a)中G_t、L_b、G_b按照公式(b)‑(e)计算：上述公式中：G_t——酶解分解液中最终的半乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；C_l——酶解分解液中最终的半乳糖浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；L_b——提取原液中的乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；C₂——提取原液中的乳糖的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；G_b——提取原液中的半乳糖含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；C₃——提取原液中的半乳糖浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；m——样品称样量，单位为克(g)；V——样品处理过程稀释体积，单位为毫升(mL)；10——单位转换系数。