一种基于体外组合组装快速定向进化DNA的方法

摘要

本发明提供了一种基于体外组合组装快速定向进化DNA的方法，属于基因工程技术领域。本发明将目标基因分成多个片段并进行体外扩增，通过在引物中引入兼并突变序列实现PCR扩增后获得含有不同突变区域的DNA片段，进而通过体外快速组装将所有片段组合为含有不同突变位点的完整基因。本方法实现了基因的快速体外进化，操作简单，可用于调控序列如启动子、核糖体结合位点等基因的快速定向进化，特别适合于对酶基因的体外高效进化改造上，结合结构分析，确定突变区域，然后进行分段克隆，可在酶基因内部引入丰富的突变多样性，进行快速定向进化。

主权项

一种基于体外组合组装快速定向进化DNA的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)亚片段突变体的制备：根据亲本基因序列及目标突变区域或位点，将亲本序列分为若干个亚片段，对每个亚片段分别设计并合成正反向两条引物，且在引物的中部位置引入目标突变序列或兼并突变序列，引物3’端的18‑24bp的序列与亚片段模板序列完全匹配，引物5’端有15‑20bp的序列与邻近的需重组亚片段的引物5’端序列完全匹配，作为DNA片段体外组装的“同源臂”；以亲本DNA基因为模板，进行平行PCR反应，分别扩增出具有重叠末端的且引入突变点的亚片段；(2)体外组装亚突变片段：将上述步骤(1)中制备好的所有亚片段组成亚片段突变文库，各片段与制备好的重组载体等摩尔比混合，利用体外组装技术，组合获得完整的基因序列与载体的重组子文库。