一种利用线虫作为生物标志物评价土壤质量的方法

摘要

本发明提供了一种利用线虫作为生物标志物评价土壤质量的方法，包括如下步骤：步骤一、土壤线虫提取、分离与鉴定，步骤二、土壤线虫群落生态指数计算。本发明利用土壤中常见的线虫作为生物标志物评价土壤质量，提出一种指标明确，结果可靠的评价标准，对土壤环境监控具有重要意义。本发明受国家转基因重大专项课题“转基因玉米小麦大豆环境安全评价技术(2014ZX08011003)”支持。

主权项

一种利用线虫作为生物标志物评价土壤质量的方法：其特征在于，包括如下步骤：步骤一、土壤线虫提取、分离与鉴定，1)土壤样本预处理：从田间采集的土样，除去残茬，石块，磨细，待用；2)土壤样本湿度测定：单独称取100g土样，在100～105℃恒温条件下，烘烤到干燥状态，并用烘干前后的重量求出土样的含水量占烘烤土样的多少；3)线虫的淘洗过筛称取鲜土100g，用淘洗—过筛—蔗糖梯度密度离心方法分离线虫，将称好的土倒入水盆中，加水搅匀，静置1min，将水倒入一组网筛，边倒边震荡分样筛，防止水充满下层而从筛中溢出，然后，再在盆中加入水后混匀，静置1min，倒入网筛中，如此重复三次，将400目的分样筛取下，用喷头把400目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中，静置；4)蔗糖梯度离心将静置烧杯中的上层水轻轻倒掉，只保留下层大约30ml水、线虫和泥浆的混合物，将混合物轻轻摇匀，倒入离心管中，在天平上调平衡，把平衡后的离心管放入离心机中，第一次离心，倒掉第一次离心后的上层水，保留下面水土混合层，往离心管中分别加入约10ml的浓度为630g/L蔗糖溶液，调平摇匀，进行第二次离心，离心后迅速把离心管取出，将上层液倒入500目筛中，然后用水冲洗，然后将线虫混合液冲入三角瓶中，最后将其转移到试管中，且静置24h，使线虫沉淀，并进行饥饿处理，最终得到各器官清楚的线虫标本，5)线虫的杀死和固定采用温和热杀死法，首先将水浴锅温度调为60℃；把静置24h以上的试管中的上层水小心抽出，只保留底部大约2～3ml的线虫液，因为线虫多集中于试管底部，操作时要避免出现大的晃动，以免线虫被重新搅动起来,影响试验结果，将抽完水后的试管放入水浴锅中加热3min,杀死线虫，取出并稍静置冷却，加入2倍于线虫液的TAF固定液，摇匀，倒入棕色小瓶中，贴好标签和写上序号，以待鉴定，6)线虫的科属鉴定将线虫液在解剖镜下观察计数，然后将土壤线虫种群数量折算成每100g干土中含有的线虫条数，随机抽取100条线虫在光学显微镜下进行鉴定，根据线虫的取食习性将其划分为四个营养类群,如下表：食细菌线虫、食真菌线虫、食植物线虫和捕食杂食类线虫；步骤二、土壤线虫群落生态指数计算土壤线虫的生态指数包括优势度指数、香农—威纳指数、均匀度指数，1)优势度指数(Dom)：公式Dom＝∑pi，pi—第i个线虫属个体所占的比例，优势度指数高，说明该地区土壤线虫优势种群比较单一，不利于土壤线虫群落的稳定性；2)香农—威纳指数(HG)：公式Hg＝∑PilnPi，Pi—属于物种i的个体在全部个体中的比例；香农—威纳指数是用来描述种的个体出现的紊乱和不确定性，不确定性越高，多样性也就越高；3)均匀度指数(Evenness)：公式Evenness＝H/Hmax＝∑PilnPi/lnS，S—物种数目，Pi—属于物i的个体在全部个体中的比例；均匀度指数是指一个群落或生境中全部物种个体数目的分配状况，它反映的是各物种个体数目分配的均匀程度。