清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法

摘要

本发明涉及一种清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，该方法包括以下步骤：⑴制备猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的对照肉品DNA模板；⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；⑶将通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按比例混合均匀后，得到多重PCR引物；⑷提取待测肉品DNA，得到待测肉品DNA模板；⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系；⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系；⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，分别得到PCR产物；⑻分别将PCR产物用琼脂凝胶电泳检测扩增结果，继而判定该待测肉品是否含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。本发明操作简便、经济省时。

主权项

清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy® Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板；⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；其中所述正向引物序列为5’‑CAAAGCTACCCTCACCCG‑3’；所述反向特异性引物序列如下所示：猪5’‑CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA‑3’，片段大小为138bp；羊5’‑TGAGGATTAGTAGGATAGCACC‑3’，片段大小为199bp；鸡5’‑GATGGCATAGGCGAATAGAA‑3’，片段大小为327bp；老鼠5’‑AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC‑3’，片段大小为378bp；牛5’‑TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT‑3’，片段大小为499bp；⑶将所述通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物；⑷提取待测肉品DNA：将待测肉品10g用液氮研磨后，使用DNeasy® Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板；⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：2×Taq PCR StarMix     15uL多重PCR引物         6.7uL对照肉品DNA模板    2.0uL灭菌蒸馏水补足至30uL；⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：2×Taq PCR StarMix    15uL多重PCR引物        6.7uL待测肉品DNA模板    2.0uL灭菌蒸馏水补足至30uL；⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物；⑻分别将10uL所述对照肉品DNA的PCR产物、所述待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当所述待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的一个泳道上出现片段大小为138bp、199bp、327bp、378bp、499bp五个条带中的一个或多个时，即判定该待测肉品含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。