用鹅胚成纤维细胞系培养小鹅瘟病毒的方法

摘要

用鹅胚成纤维细胞系培养小鹅瘟病毒的方法。属于兽用生物制品领域。它解决了现有的小鹅瘟病毒培育方法生产效率较低的问题。该方法步骤如下：原代细胞培养：取发育良好的鹅胚，经剪成小块并洗涤后消化，经洗涤后吹打分散消化细胞，得到细胞悬液，培养至细胞形成完整单层后，得到原代细胞；鹅胚成纤维细胞系的建立：将鹅胚成纤维原代细胞弃去培养液，洗涤、消化，培养至形成完整单层细胞，得到F1代细胞，可传3代；繁殖与收获：将形成70%单层的F1～F4代细胞接毒，当75%以上细胞出现病变时，收获繁殖病毒。本发明收获的病毒液量是原代细胞接毒培养量的255倍，较细胞形成100%单层时接毒培养收获的病毒液毒价高10~100倍。

主权项

用鹅胚成纤维细胞系培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：（一）鹅胚成纤维原代细胞的培养：取12日龄发育良好的鹅胚，用碘酒棉及酒精棉对蛋壳气室部位消毒，无菌取出鹅胚，去头四肢和内脏，放入灭菌的玻璃平皿内，用DMEM溶液洗涤胚体三次，用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用DMEM溶液洗2次，然后加入0.25%胰酶溶液（每个鹅胚加3~5ml），在37.5℃水浴中消化5~10min，吸出胰酶溶液，用DMEM溶液洗涤2次，然后加入含8%犊牛血清、pH值7.0~7.5的DMEM溶液吹打分散消化细胞，过滤后得到每毫升含活细胞数100~150万的细胞悬液，分装于培养瓶中，37℃恒温静止培养，细胞形成完整单层后，得到鹅胚成纤维原代细胞；（二）鹅胚成纤维细胞系的建立：将步骤（一）中得到的鹅胚成纤维原代细胞弃去培养液，加入PBS缓冲液洗涤2次，吸出洗液，然后加入0.25%胰酶溶液，37.5℃培养消化3~5min，当单层细胞拉空、边缘脱离瓶壁时，吸出消化液，加入营养液并吹打分散消化细胞；按80~100万/ml的细胞浓度加入营养液，分装于培养瓶中培养，37℃恒温静止培养至形成完整单层细胞，即得到F1代细胞；然后将F1代细胞继续传代培养，可传3代，得到F1~F4代细胞；所述的营养液为含8%犊牛血清、pH值7.0~7.5的DMEM溶液；（三）小鹅瘟病毒的繁殖与收获：步骤（二）培养的鹅胚成纤维细胞F1～F4代用于病毒繁殖，将形成70%单层的F1～F4代细胞弃去培养液，按1ml/中方瓶的接种量接入小鹅瘟病毒毒种，37℃吸附培养1h，然后弃去病毒吸附液，10ml/中方瓶的量加入营养液，37℃恒温静止培养72~96小时，当75%以上细胞出现病变时，收获繁殖病毒，将病毒培养瓶反复冻融三次，无菌收集细胞培养液；所述的营养液为含8%犊牛血清、pH值7.0~7.5的DMEM溶液。