一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法

摘要

本发明公开了一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，通过配置反应液及显色液，制备标准曲线，最后可获得待测样品的氨基酸脱羧酶的酶活力。该方法成本低廉；重复性好，在酶浓度在0.001U~0.006U/μL之间线性关系良好；操作简单，仪器要求不高；方法可靠，适用面广，可检测多种氨基酸脱羧酶。本发明方法的公开，对于研究动物组织、微生物培养液、细胞培养以及血液样本中的氨基酸脱羧酶活力变化至关重要。

主权项

一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，其具体步骤如下：（1）反应液与显色液试剂组成及配制反应液：即配即用，将试剂2溶于试剂1中即可；试剂1：50 mmol/L Tris，pH7.5，10 mmol/L MgCl₂，2mmol/LPEP单环已胺盐，5 mmol/L氨基酸；所述的氨基酸为待检测的氨基酸脱羧酶对应的氨基酸； 试剂2：5 U/mg PEP羧化酶；显色液：试剂3：50 mg/ml 固紫B， 1% 吐温‑80溶液，采用无CO₂蒸馏水配制；试剂4：脱羧酶标准品以上溶液均采用无CO₂双蒸水配制；（2）标准曲线试剂配制将脱羧酶标准品配制成0，0.001，0.002，0.003，0.004，0.005，0.006，0.007，0.008 U/μL浓度梯度的酶溶液，溶剂为匀浆介质；pH 7.4，0.01mol/L Tris‑Hcl，0.0001mol/L EDTA‑2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠溶液；（3）标准曲线的制备① 移取450 μL反应液到离心管；② 加入50 μL步骤（2）中配制的标准品，上下颠倒数次，混匀；③ 37℃下孵育1 h，每隔10 min上下颠倒混匀数次；④ 加入25 μL显色液与反应体系中，上下颠倒数次，混匀；⑤ 静置5 min，1 cm光径，蒸馏水调零，520 nm，测各管吸光度（OD）值；⑥ 重复实验步骤①至⑤9次；⑦ 构建标准曲线：纵坐标（Y轴）为吸光单位的实际读数；横坐标（X轴）为标准脱羧酶酶活力单位（U），为标准品酶浓度×50μL；（4）待测样品测定方法① 移取450 μL反应液到离心管；② 向离心管中加入50 μL待测样品或50 μL匀浆介质；上下颠倒数次，混匀；③ 37℃下孵育1 h，每隔10 min上下颠倒混匀数次；加入25 μL显色液于反应体系中，上下颠倒数次，混匀；④静置5 min，1 cm光径，蒸馏水调零，520 nm，测各管吸光值OD；⑤ 根据OD_实际和标准曲线计算样品对应的酶浓度E_实际，U/μL，E_实际与曲线x的值的对应关系为：E_实际＝x／50；⑥ 计算样品比活力：E_样品=E_实际×样品稀释倍数÷样品总蛋白浓度。