一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法

摘要

本发明提供了一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法。本发明经过噬斑克隆纯化筛选出的仓鼠肺细胞适应毒能够稳定产生细胞病变，毒价稳定在10^7.0～10^8.0TCID50/mL，免疫原性稳定。利用仓鼠肺细胞系繁殖猪流行性乙型脑炎病毒，病毒适应性好、制苗毒液效价高。本发明采用先分离后浓缩的浓缩病毒工艺技术，利用中空纤维膜澄清纯化系统，实现了病毒液和细胞碎片的分离，解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集的难题，还有效降低了灭活疫苗成品副反应性，提高了灭活疫苗安全性。本发明灭活剂选用二乙烯亚胺取代甲醛，其对病毒抗原的破坏作用小，保证了抗原中有效免疫原的完整性。

主权项

一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取中国仓鼠肺细胞CHL株或V79株经EDTA‑胰酶细胞分散液消化传代，而后继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒；2)采用噬斑纯化法以与步骤1)选用的同种细胞株为宿主对猪流行性乙型脑炎病毒进行克隆纯化，筛选适应性克隆毒株，待用；3)取步骤1)中得到的细胞株，弃去培养液，按MOI＝0.1～0.001接入步骤2)得到的适应性克隆毒株，先行吸附30min～1h，然后补加细胞维持液继续培养72～96h，细胞病变达到80％以上时收获，得到收获液；4)先用中空纤维分离膜对步骤3)得到的收获液进行分离，再将滤液用超滤膜进行浓缩纯化，浓缩2～10倍，即为浓缩毒液；5)以0.1～0.5％(v/v)的比例向步骤4)得到的浓缩毒液中加入二乙烯亚胺，混合均匀，于25～35℃条件下灭活2～3d，得到灭活毒液；6)利用凝胶层析柱，以Sepharose 4FF作为层析介质、pH7～7.5的PBS为洗脱液对步骤5)得到的灭活毒液进行层析纯化；7)取步骤6)纯化后的病毒液与疫苗油佐剂按照1:1.5～1:3(v:v)的比例混匀，而后乳化得到猪流行性乙型脑炎灭活疫苗。