一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法

摘要

一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，它涉及一种筛选中药药效物质基础的方法。本发明要解决现有茵陈蒿汤筛选有效成分时间周期长、耗费大及成本高的问题。本发明方法：一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立；二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立；三、PCMS研究方法的建立。本发明提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点。本发明用于筛选药效物质基础。

主权项

一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于它包括以下步骤：一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：(1)供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g栀子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为1g/mL，制成冻干粉备用；(2)体内分析样品的制备：将步骤(1)制备的冻干粉加水配成浓度为0.65g/mL的溶液，以1mL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后取血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品；(3)通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个，测出21个成分的峰面积x_i,j。二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：(1)样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型组口服体积百分含量为20％的CCL₄油溶液，剂量为1mL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵陈蒿汤剂量为1mL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉采血制备血液样品保存；(2)样品分析：将尿液和血液样品均于4℃、8000rpm～12000rpm条件下离心5min～10min，取上清液，供UPLC‑Q‑TOF/MS分析；其中，高效液相色谱条件为：色谱柱填料ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈，规格为50mm×2.1mm，1.7μm；柱温为35℃；流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.40mL/min～0.60mL/min，检测波长245nm，进样量2.0μL；其中，质谱条件为：尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为500L/h～600L/h，温度为300℃，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110℃，毛细管电压为2.5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3.0V，微通道板电压为1600V；每0.1s采集一次；采用亮氨酸‑脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/z100～1000；血液样品：脱溶剂气流量为450L/h～650L/h，其余参数与尿液样品参数相同；(3)CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用SPSS17.0分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献率的生物标记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢组中20个生物标记物为C₁₀H₂₂O₈、C₁₄H₁₈O₅、C₁₄H₁₈N₂O₄、C₉H₇NO₂、C₁₆H₃₁NO₂、C₁₆H₁₂O₅、C₁₂H₁₆N₂O₃、C₁₂H₁₈N₂O₃、C₁₆H₃₁NO₅、C₁₂H₂₀N₄O₅、C₂₄H₃₄O₂、C₂₆H₄₃NO₆、C₁₀H₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₂₄H₃₆O₃、C₆H₇N₅O、C₅H₉NO₃、C₂₄H₃₂O₂、C₁₁H₂₀N₂O₃和C₁₅H₂₂O₃；血液代谢组中12个生物标记物为C₃H₅NO₃、C₁₆H₁₈N₃O₃、C₈H₁₀O₆、C₂₀H₃₆N₆O₂、C₁₀H₈O、C₂₆H₃₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₃₃H₄₉NO₄、C₈H₄O₃、C₁₂H₁₃NO₂、C₂₄H₃₆O₃和C₂₂H₄₀O₄；三、PCMS研究方法的建立：(1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化：设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化y_i,j，$y_{i,j}=(x_{i,j}-{\bar{x}}_j)/{\delta }_j,$其中为指标j的平均值，δ_j为指标j的标准差，x_i,j为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的21个峰面积。(2)代谢生物标记物的相对强度的数据标准化：设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为X_n,k、X_m,k，讲这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：${\Delta }_K=[(X_{m,k}-X_{n,k})-\bar{X}]/{\delta }_k$其中△_K为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X_m,k为步骤二中的生物标记物k治疗后的相对强度；X_n,k为步骤二中的生物标记物k治疗前的相对强度；X为步骤二中的生物标记物k的平均值；δ_k为指标k的标准差。(3)变量相关分析：$|y_{i,j}=(x_{i,j}-{\bar{x}}_j)/\mathrm{\delta j}|\frac{\mathrm{Pearson}}{\mathrm{Correlationanalysis}}|{\Delta }_k=[(X_{m,k}-X_{n,k})-\bar{X}]/{\delta }_k|;$通过上述公式得出变量R，R_nm表示成分n在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联矩阵，r表示相关系数；通过R确定药效相关成分对药效指标的作用，其中0.5＜|r|≤1表示显著相关，从而筛选出中药药效物质基础。