一种烟草野火病病菌分离方法

摘要

本发明公开了一种烟草野火病菌分离方法，选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；将病斑的中心点切成“+”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3~1/2处；在凹槽中滴加150~300μL无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释5^3~5或10^3~5倍的稀释液100~200μL涂布于KMB培养基平板，在24~28℃下培养48~72h；在紫外光下选择有绿色荧光的单菌落，经致病力测定，形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。本发明集分离、纯化、鉴定为一体，分离病菌效率高、准确性强，适用于田间采样的及时分离，分离病菌的纯度高，保持了病菌野生型特性。

主权项

一种烟草野火病病菌分离方法，其特征在于包括以下步骤：A、选择病斑：选典型烟草野火病病株，取干燥、干净病叶，将其上的病斑沿病健交界处剪下；B、收集喷菌液：将病斑的中心点切成“+”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽边缘、切口位于凹槽1/3~1/2处；在凹槽中滴加150~300μL无菌水，盖上盖玻片，选取有喷菌现象的凹玻片收集喷菌液；C、分离扩繁：在无菌条件下将喷菌液5倍或10倍倍比梯度稀释，取稀释5^3~5或10^3~5倍的稀释液100~200μL涂布于KMB培养基平板，在24~28℃下培养48~72h；所述的KMB培养基按以下配比制备：月示蛋白胨20g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁1.5g或硫酸镁0.738g、甘油10ml、琼脂17~20g，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至7.0~7.2；D、菌落选取：取培养基平板置于紫外光下观察，选择绿色荧光的单菌落；蘸取大小相当、形态相似的有绿色荧光的10~15个单菌落，加入到灭菌蒸馏水中，配成10⁶~10⁷CFU/mL的菌悬液；用带针头的针管吸取菌悬液，将菌悬液接种到烟草样本植株上，接种位置是烟苗叶片背面的叶肉，每株接种7~9个点，每个点接种0.1~0.2mL；然后在24~28℃下恒温培养，每12h光照/黑暗交替一次，相对湿度大于80%，如此培养7天后形成褐色枯死病斑和淡黄色晕圈的即为目标菌落。