脑苷脂的制备、纯化及含量检测方法

摘要

本发明公开了一种脑苷脂的制备、纯化及含量检测方法，属于脑苷脂的制备领域。本发明所述脑苷脂的制备方法包括：将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵，得到含有脑苷脂的菌丝体。本发明对液体发酵中各步骤中的培养基的组成和培养条件进行了优化和筛选，最大限度的提高了脑苷脂的产率。本发明还公开了一种从上述菌丝体中分离纯化脑苷脂及其含量检测的方法。本发明利用块菌液体发酵生产脑苷脂与现有的脑苷脂生产方法相比，具有成本低、周期短、操作简单、质量可控、分离过程简单等优点。

主权项

从含有脑苷脂的菌丝体中分离纯化脑苷脂的方法，其特征在于，包括：（1）将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵得到的生物发酵产物在8000‑15000转/分钟的转速下离心，收集发酵菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；（2）制备发酵菌丝体待分离纯化样品，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的活性成分，得菌丝体待分离纯化样品；（3）将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；以体积比为85：15的氯仿：甲醇系统作为洗脱液；将凝胶以二氯甲烷‑甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于二氯甲烷‑甲醇中，进行上样吸附，然后用二氯甲烷‑甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得；所述的生物发酵依次包括以下步骤：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体发酵；所述的一级液体种子培养的培养基组成和培养条件分别为：(1)培养基组成：葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸镁20克/升、磷酸二氢钾30克/升；pH值为8.0；(2)培养条件：培养温度35℃，摇床转速为250转/分钟；所述的二级液体种子培养的培养基和培养条件为：(1)培养基组成：培养基组成为：葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁1克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为5.5；（2）培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟；所述的液体发酵的培养基组成和发酵条件为：（一）摇瓶规模：（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7；（2）摇瓶中的发酵条件：发酵温度30℃，摇床转速为150转/分钟；（二）生物反应器规模：（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸镁10克/升、磷酸二氢钾10克/升，pH值为7；（2）发酵条件：发酵温度30℃，搅拌转速为600转/分钟，通气速率为50升/分钟；所述的块菌属选自中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)或夏块菌(Tuber aestivum)。