利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法

摘要

本发明公开了一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，包括：1）PCR扩增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重组基因的同源序列；2）抗性基因片段与克隆质粒连接后，转化至大肠杆菌中，经筛选得到克隆质粒；3）以步骤2）得到的克隆质粒为模板，设计引物PCR扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；4）将同源重组DNA片段电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5）转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，筛选获得阳性重组子。该方法不需要将目的重组基因克隆，简单、快捷，且能进行多次基因操作，具有广泛的应用前景。

主权项

一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）以携带第一抗性基因的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；短的同源序列是指设计在PCR引物上的、与需要进行重组的目的基因同源的序列，长度在39到50碱基；2）将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；3）以步骤2）的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段，该同源重组DNA片段中间为抗性基因，抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列；其中，保护序列是长度为400‑700碱基对的保护序列；4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6‑red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5）将步骤4）的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，抗性筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。