单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法

摘要

本发明应用双功能纳米金磁微粒，提供一种集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析技术，快速检测单核增生李斯特氏菌的检测方法。将免疫磁分离和免疫层析有机整合，免去了将单核增生李斯特氏菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将胶体金喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。该检测方法基本思路是探索纳米金磁微粒和抗体有效结合的方式，优化其富集单核增生李斯特氏菌的条件，以免疫层析技术为载体，以双抗夹心为检测原理，进行快速定量检测。

主权项

单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）制备偶联单抗的金磁微粒；取抗单核增生李斯特氏菌单抗与纳米金磁微粒混合；在温度37℃时，放在转速为10‑15rpm的旋转仪上，偶联时间30~60min，磁分离3~5min，弃上清；用清洗缓冲液清洗3遍之后，用1mL封闭剂与磁珠混合封闭1h；2）使用偶联单抗的金磁微粒捕获菌：培养单核增生李斯特氏菌，将菌液浓度调整为107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1 mL备用；取待测样品溶液1 mL、各浓度菌液1 mL，分别与步骤1）所得偶联单抗的金磁微粒100~150μg，温度37℃，转速10‑15rpm混合孵育30~60min，；孵育后磁分离3~5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中；3）制作免疫层析试纸条；将单核增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线T线和质控线C线，浓度均为1.0~2.0mg/mL，喷量均为0.5~1.0μL/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸、滤纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的条子，装卡；将制备好的试纸条置于锡箔袋中加干燥剂密封，置于干燥缸保存备用；4）利用双抗夹心法对样品进行测定；将捕获到菌的金磁微粒稀释到浓度50 ~150 μg /mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10min后用免疫层析分析仪读取，记录T线吸光度、C线吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有单核增生李斯特氏菌，T线不显色则说明样品中没有单核增生李斯特氏菌或是含有单核增生李斯特氏菌的量低于最低检测下限104CFU/mL；6）定量分析：使用免疫层析分析仪测量T线、C线的吸光度，T线和C线的吸光度的比值记为T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线；参考所做的标准曲线图，确定普通样品中的单核增生李斯特氏菌数量。