一种应用斑马鱼骨质疏松模型筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法

摘要

本发明公开了一种改进的模式生物斑马鱼骨质疏松模型应用方法，以及其在联合现代色谱技术筛选中药抗骨质疏松活性成分的应用。该方法结合现代色谱及其联用技术的高效分离、分析中药成分的特点，定向捕获或敲除、鉴定目标成分或成分群，将所捕获或敲除的成分或成分群用斑马鱼骨质疏松模型进行抗骨质疏松活性筛选。通过优化的色谱、质谱条件分离、分析中药成分，依据紫外吸收、分子量等特征分析中药成分，根据需要灵活确定目标成分或成分群，收集不同保留时间段的目标成分或成分群峰，即获得捕获或敲除的中药成分或成分群，去除有机溶剂后用适当的溶媒溶解，采用糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型快速评价捕获或敲除的中药成分或成分群的抗骨质疏松活性。现代色谱及其联用技术克服了传统化学成分分离速度慢、大量量微成分难以获得的缺陷，建立斑马鱼骨质疏松模型突破了量微成分难以进行在体抗骨质疏松活性高效评价的瓶颈，二者有机联合，可突破评价模型和化合物数量制约，实现高效筛选中药抗骨质疏松的药效物质基础。

主权项

一种斑马鱼骨质疏松模型的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：利用现代色谱或其联用技术分离、分析中药成分，捕获或敲除目标成分或成分群峰，去除有机溶剂后用适当的溶媒溶解，配制成不同浓度，供斑马鱼骨质疏松模型进行活性筛选；步骤二：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在 14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26°C‑30°C恒温培养箱中培养；步骤三：给药方案：取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1‑2mL，每个孔里放1‑10条幼鱼，分为数组，每组10‑15条鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组，从受精后4天或受精后5天开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C‑30°C恒温培养箱中培养，培养周期5‑7天，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9‑11天或者10‑12天；步骤四：将斑马鱼置于MS‑222(100 mg/L)中麻醉致死，去除MS‑222溶液，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2‑3 h，将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于PBST溶液中洗涤3次，每次10min，然后置于含3%H2O2和1%KOH的混合溶液中漂白30 min~2 h，至斑马鱼眼部色素清除后去除漂白液，再用PBST洗涤幼鱼3次，每次10 min，将幼鱼置于茜素红染色液中数小时至过夜，去除染色液后，依次通过3:1、1:1、1:3的1%KOH和甘油的混合溶液透明幼鱼，最后保存于纯甘油中；步骤五：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤(4)中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置；用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t‑检验。