通过荧光定量PCR检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法

摘要

转基因作物对土壤根际微生物的影响是环境生物安全研究的重要方面。本文对转基因抗病小麦根际土壤中荧光假单胞菌数量进行绝对定量，建立了实时荧光定量PCR（Real-TimeQPCR）检测体系。应用该反应体系，对转基因小麦各个生长时期根际土壤的荧光假单胞菌拷贝数进行绝对定量。结果表明，该设计引物具有较好特异性；Real-TimeQPCR反应的扩增曲线中各梯度标准质粒的循环阈值（Ct值）间隔均匀，熔解曲线峰值较突出，该标准曲线的相关系数R2=0.99905，斜率为-3.203，计算其扩增效率E=100%。在转基因小麦的播种期、返青期、灌浆期和成熟期，根际土壤荧光假单胞菌数量呈现逐渐上升的趋势。

主权项

建立应用荧光定量PCR方法检测转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet)数量的检测体系,其特征在于：利用荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对转基因小麦根际土壤样本的总DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段，具体步骤如下：a）在田间播种转基因小麦，设置四个重复；分别在小麦生长发育的播种期、拔节期、灌浆期、成熟期采用对角线5点取样法采集根际土壤样本；b）应用UltraCleanTM soil DNA Isolation Kit试剂盒（Mo‑Bio，USA）分别提取转基因小麦根际土壤样本的总DNA，并将该样本的总DNA溶于ddH2O中；以荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物S EQ ID No.1和SEQ ID No.2，对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段；并进行克隆测序，分析得到阳性克隆后提取质粒，构建标准曲线；由实时荧光定量PCR仪时根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中荧光假单胞菌拷贝数；c）应用定量PCR引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行荧光定量扩增，将不同时期土壤样本中荧光假单胞菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌拷贝数变化趋势；所述的标准曲线为Y1=‑3.320X1+38.843，R2=0.99905，其中Y1为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X1为荧光假单胞菌的标准质粒拷贝数对数值。