蛋白质的重折叠方法

摘要

通过本发明，可以提供如下方法：通过在pH6.5～9.0下，将失去了高级结构的蛋白质和月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂的1～3％水溶液相接触，得到该蛋白质的可溶化液，将得到的可溶化液加入含有0.1～1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5～9.0的缓冲液中，通过使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂降低至0.02～0.275％，生产恢复了天然状态的高级结构的蛋白质。通过本发明，可以在将表面活性剂平稳地从蛋白质上脱离的同时，能够简便地恢复蛋白质中的天然状态的高级结构。

主权项

由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质来制造恢复了其天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：(1) 通过在pH6.5~9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有Ｃ8~Ｃ16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1~3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，前述具有C8~C16的酰基的二羧酸选自月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸及月桂酰亚氨二醋酸，(2) 通过将得到的可溶化液加入含有0.05~1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5~9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02~0.5%的工序，前述精氨酸衍生物选自乙酰精氨酸、N‑丁酰精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5‑胍基‑2羟基‑戊酸，(3) 回收恢复了其天然状态的高级结构的蛋白质的工序。2. 权利要求1的制造方法，其中，前述表面活性剂为具有前述C8~C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸或者它们的盐。3. 权利要求1或2的制造方法，其中，前述表面活性剂为具有前述C8~C16的酰基的二羧酸或其的盐。4. 权利要求1或2的制造方法，其中，在前述工序(1)和前述工序(2)之间，含有将由前述工序(1)得到的可溶化液稀释，得到前述表面活性剂的浓度为0.8~1.5%、pH为6.5~9.0的稀释液，将得到的稀释液于5℃~40℃保持0.5小时以上的工序(A)。5. 权利要求1或2的制造方法，其中，在前述工序(2)中，使前述表面活性剂的浓度及精氨酸或前述精氨酸衍生物的浓度阶段性地或逐渐地降低，于5~48℃维持1小时~5天。6. 权利要求1或2的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为基因重组蛋白质。7. 权利要求1或2的制造方法，其中，前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质为在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质。8. 权利要求7的方法，其中，前述在结构域上具有免疫球蛋白结构的蛋白质为具有一部分抗体结构域的抗体片段、双抗体或小型抗体的人工抗体、或者Fc融合蛋白质。9. 权利要求8的方法，其中，前述抗体片段为scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2。10. 权利要求8的方法，其中，前述Fc融合蛋白质为将细胞因子、受体细胞外域或肽融合于抗体Fc结构域而成的蛋白质。11. 权利要求1或2的制造方法，其中，在恢复了天然状态的高级结构的蛋白质为具有二硫键的蛋白质的情况下，进一步含有通过使前述经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质发生氧化还原反应而形成分子内或分子间二硫键的工序(B)。12. 权利要求11的制造方法，其中，前述工序(B)中的前述氧化还原反应通过在由前述工序(1)得到的可溶化液或由前述工序(2)得到的缓冲液中加入氧化还原物质或铜离子来进行。13. 使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质来恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，(1) 通过在pH6.5~9.0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有Ｃ8~Ｃ16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1~3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，前述具有C8~C16的酰基的二羧酸选自月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸及月桂酰亚氨二醋酸，(2) 通过将得到的可溶化液加入含有0.05~1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5~9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0.02~0.5%的工序，前述精氨酸衍生物选自乙酰精氨酸、N‑丁酰精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5‑胍基‑2羟基‑戊酸。14. 由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复了其天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：(1) 通过在pH6.5~9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1~3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2) 通过将得到的可溶化液加入含有0.1~1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5~9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02~0.275%的工序，前述精氨酸衍生物选自乙酰精氨酸、N‑丁酰精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5‑胍基‑2羟基‑戊酸。15. 使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序：(1) 通过在pH6.5~9.0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1~3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2) 通过将得到的可溶化液加入含有0.1~1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物的pH6.5~9.0的缓冲液中，使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的浓度降低至0.02~0.275%的工序，前述精氨酸衍生物选自乙酰精氨酸、N‑丁酰精氨酸、精氨酸丁酯、胍丁胺及5‑胍基‑2羟基‑戊酸。