一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法

摘要

本发明涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括将从鲤鱼肝脏中提取含有受体的细胞溶质与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合形成复合物后，再与用特异性引物合成的结合DNA结合形成配体-受体-DNA复合物，用核酸外切酶III和S1核酸酶消解。酶切后的产物作为模板，进行分子信标荧光定量PCR扩增，得到加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程，结合定量DNA标准曲线，经线性回归分析，得到邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，可进行不同浓度邻苯二甲酸酯的检测。本发明具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。

主权项

一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括：（1）将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4ml:1g的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；（2）将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；其中，PCR扩增引物碱基序列为上游引物F1：5'CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG3'，下游引物F2：5'GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG3'；（3）将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10‑1g/L‑10‑9g/L，取10μl与250μl的细胞溶质混合，于20℃振荡温育2h；（4）从上述混合物中取20μl加入1.5mlEP管中，20℃温育15min后，再加入2μl结合DNA，继续20℃温育15min得配体‑受体‑DNA复合物；从复合物中取12μl再加入2μl ExoⅢbuffer 和6μl HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min，再加入ExoⅢ100U，混匀后37℃温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5μl，加入15μl S1核酸酶混合液，于37℃温育30min进行再次消解；再加入1μl S1核酸酶停止液，70℃灭活15min；得到分子信标PCR的模板；（5）以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72℃延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为：上游引物R1:5'CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG3'；下游引物R2:5'GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG3'，分子信标探针的序列为：5'FAM–CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG‑DABCYL3'；分子信标荧光定量PCR扩增体系为：每50μl体系中包括含25μmol/L MgCl2的反应缓冲液5μl、1.25mmol/L dNTP4μl、50μmol/L上下游引物各0.2μl、TaqDNA聚合酶0.3μl、探针0.3μl、模板5μl和灭菌双蒸水35.8μl，TaqDNA聚合酶浓度为3U/μl；分子信标PCR循环步骤为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；（6）根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。