温敏性固定化木瓜蛋白酶及其在制备单克隆抗体中的应用

摘要

本发明提供了一种温敏性的固定化木瓜蛋白酶，及其在制备单克隆抗体中的应用。本发明采用温敏性材料聚（N-异丙基丙烯酰胺）为制备载体固定化木瓜蛋白酶，该材料具有的特性是：在常温下溶于水形成均相，当温度超过其最低临界溶解温度时便固相析出，以此为载体制备的固定化酶具有了热应答性质，将传统固定化可重复利用等优点及可溶性酶较少扩散限制等优点结合在一起。本发明提供了一种操作简单、对温度敏感的溶解-沉淀的固定化酶的制备方法，并将此固定化酶用于制备单克隆抗体片段。

主权项

一种温敏性的固定化木瓜蛋白酶，由如下方法制备得到：（1）将DMF用分子筛干燥，温敏性载体溶于干燥过的DMF中，温敏性载体与DMF的比例是1g：1～10mL，得到载体溶液；所述温敏载体为N‑羟基琥珀酰亚胺酯封端的聚（N‑异丙基丙烯酰胺）；（2）将木瓜蛋白酶溶于pH7.5～10.0的硼酸盐缓冲液中，调酶液浓度至1～10mg/mL，得到酶溶液；（3）将载体溶液与酶溶液以1：4～6体积比混合，于4～55℃反应1～8h，反应液用pH7.5～10.0的硼酸盐缓冲液稀释；（4）40℃空气浴中，11000r/min离心20min，除去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，再于相同条件下离心；（5）重复步骤（4）的操作2～3次，最后所得沉淀溶于新配的磷酸盐缓冲液中，4℃保存，即得温敏性的固定化木瓜蛋白酶溶液。