家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法，包括：(1)进行蝎毒素蛋白BmK基因的克隆；(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化所述pCR2.1-BmK基因得到BmK基因片段，然后将BmK基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPVDNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒；(3)使用家蚕培养细胞，接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV，在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。本发明解决了蝎毒素蛋白容易失活的缺点，为开发蝎毒素蛋白作为生物杀虫剂创造了条件。

主权项

一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法，其特征在于包括：(1) 按以下方法进行蝎毒素蛋白BmK基因的克隆：以从蝎子抽提的总RNA为模板，利用RT‑PCR扩增反应得到蝎毒素蛋白BmK基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下：正向引物为含有BamHI酶切位点的5’ GGATCCATGGATGGATATATAAG 3’，反向引物为含有HindIII酶切位点的5’ AAGCTTTTACTTTTTTCCACCGC 3’；所述RT‑PCR扩增反应为：一个循环，94°C模板变性3分钟；接着30个循环，94°C 变性50 秒，55°C退火30 秒，72°C延伸1分钟；最后1个循环，72°C延伸10 分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳对所述蝎毒素蛋白BmK基因进行PCR产物分析和纯化，随后将目的PCR产物克隆进TA载体pCR2.1，得到pCR2.1‑BmK基因，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认所述pCR2.1‑BmK基因的顺序的正确性；(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化所述pCR2.1‑BmK基因得到BmK基因片段，然后将BmK基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；按以下方法将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒：在聚苯乙烯锥形管中按1:15的质量比加入所述重组的转移载体的DNA和家蚕BmNPV 的DNA，并在加入脂质体lipofectin后混匀，最后加入灭菌蒸馏水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积与其中的所述脂质体lipofectin的体积比为20：7；将所述混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC‑100培养基培养24小时，再用含有10% 胎牛血清的新鲜培养基在27℃条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，对所述病毒储存原液进行空斑筛选而获得含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒；(3) 使用家蚕培养细胞，接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV，在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。