一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法

摘要

本发明提供了一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，实现定量检测人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的抗原/抗体的含量，以解决现有技术成本较高、步骤繁琐、反应可控性差、不具有通用性等问题。该方法主要包括以下步骤：1)用金磁微粒制备免疫磁珠；2)用Ru(bpy)32+标记抗原/抗体；3)定量测定抗原/抗体标准曲线的建立；4)检测待测样品；采用一种新型电化学发光免疫分析技术，具有操作简便，Ru(bpy)32+标记抗体的过程不影响抗体效价，标记成本低，具有通用性等优点。

主权项

一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，包括以下步骤：1)用金磁微粒制备免疫磁珠采用偶联缓冲液稀释与待测对象相应的捕获抗体/抗原，得到捕获抗体/抗原溶液；移取金磁微粒于离心管中，加入偶联缓冲液轻摇混匀，磁性分离弃上清；取所述抗体/抗原溶液加入到所述装有金磁微粒的离心管中，轻摇混匀，将离心管固定于恒温摇床中振荡反应，待反应完毕后磁性分离弃上清，将清洗缓冲液加入到该离心管中轻摇混匀，磁性分离弃上清；在该离心管中加入封闭剂，并将其置于恒温摇床中振荡反应，待反应结束后磁性分离弃上清；最后加入保存缓冲液，轻摇混匀，制得免疫磁珠，保存备用；2)用Ru(bpy)32+标记抗体/抗原另取对应于所述捕获抗体/抗原的检测抗体/抗原，用标记缓冲液进行充分透析；取Ru(bpy)32+‑NHS ester并将其溶解于DMSO中；调整检测抗体/抗原与Ru(bpy)32+‑NHS ester的摩尔比，使其达到最佳标记比例；将两者混合加入离心管中，在恒温摇床中避光反应；待反应结束向上述离心管中加入100μL、2M的甘氨酸溶液，继续避光反应10min以终止反应；将离心管中的反应物用保存缓冲液避光透析；透析后即得到Ru(bpy)32+标记的抗体/抗原，保存备用；3)定量测定抗原/抗体的标准曲线的建立取多支反应管，分别向每支反应管中加入定量的所述免疫磁珠、不同浓度的抗原/抗体标准品、所述Ru(bpy)32+标记的抗体/抗原，将其置于恒温摇床中反应，形成磁性免疫复合物：免疫磁珠‑抗原‑Ru(bpy)32+标记的抗体免疫复合物；免疫磁珠‑抗体‑Ru(bpy)32+标记的抗原免疫复合物；免疫磁珠‑抗原‑抗体‑Ru(bpy)32+标记的二抗免疫复合物；清洗并重悬免疫复合物，再将其加入到电化学发光免疫分析仪的检测室，同时引入含TPA的ECL缓冲液，然后启动电化学发光反应，记录发光值，制作标准曲线；4)检测待测样品取反应管，加入定量的所述免疫磁珠、待测样品、所述Ru(bpy)32+标记的 抗体/抗原，将其置于恒温摇床中反应，形成所述免疫复合物；清洗并重悬该免疫复合物，然后再将其加入到电化学发光免疫分析仪的检测室，同时引入含TPA的ECL缓冲液，启动电化学发光反应；记录发光值，通过所述标准曲线计算待测样品中抗原/抗体的浓度。