发明名称 |
一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法 |
摘要 |
本发明提供一种制备人血清白蛋白-人甲状旁腺激素的方法。通过对酵母宿主SMD1168进行改造,敲除SMD1168基因组上yapsin1的编码序列。本发明在SMD1168的基础上进一步将yapsin1的编码基因YPS1敲除即实现了蛋白酶A和yapsin1的双重敲除,将该改造宿主命名为SMD1168yps1△。再利用上述改造宿主来优化重组表达人血清白蛋白-人甲状旁腺激素(1-34)融合蛋白,从而减少表达过程中的目的蛋白的降解,降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度,。本发明提供的优化人血清白蛋白-甲状旁腺激素(1-34)融合蛋白可在制备治疗骨质疏松的PTH(1-34)药物中的应用。 |
申请公布号 |
CN102676563A |
申请公布日期 |
2012.09.19 |
申请号 |
CN201210134869.6 |
申请日期 |
2012.05.03 |
申请人 |
浙江大学 |
发明人 |
吴敏;沈其;王芙蓉;徐迎春;陈枢青 |
分类号 |
C12N15/62(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;A61K38/29(2006.01)I;A61K47/48(2006.01)I;A61P19/10(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/62(2006.01)I |
代理机构 |
杭州求是专利事务所有限公司 33200 |
代理人 |
张法高;赵杭丽 |
主权项 |
一种制备人血清白蛋白‑人甲状旁腺激素的方法,通过以下步骤实现:(a)设计YPS1的5’端同源臂以及3’端同源臂扩增引物,并从毕赤酵母基因组中有效扩增出这两个同源臂序列;其中用于扩增YPS1 5’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.1:5’‑aagcctgcag agctccattg cgccaacccc‑3’,划线部分为PstⅠ酶切位点,下游引物序列SEQ ID NO.2:5’‑cggcgtcgac aatctggctg agcggaaagt ttga‑3’,划线部分为SalⅠ酶切位点,用于扩增YPS1 3’端同源臂序列的上游引物序列SEQ ID NO.3:5’‑cccagatctc acatttcgcg cctgccttcc t‑3’, 划线部分为BglⅡ酶切位点,下游引物序列SEQ ID NO.4:5’‑aaactgcagg ggtgagcctg tctggccct‑3’,划线部分为PstⅠ酶切位点;(b)将步骤(a)中得到的这两个同源臂序列按照先后顺序插入到载体pPICZαB中,获得用于后续同源重组的重组载体pPICZαB‑YPS1△,序列为SEQ ID NO.12;(c)将步骤(b)中构建的重组载体用单一限制性内切酶酶切后转染SMD1168,用含有Zeocin的选择压力的培养筛选重组子,用相应的阳性引物和阴性引物验证同源重组的正确性,正确的缺陷型重组子记为SMD1168 yps1△;其中阴性引物序列为:5’‑ctc ctt cca ccg cca cgg c‑3’,5’‑ acc act tga ggc gtc ctt gga‑3’,阳性引物序列为SEQ ID NO.7:5’‑ atg gag gag ttg agg acc ‑3’,5’‑ gca aat ggc att ctg aca tcc‑3’;(d)利用步骤(c)中得到的蛋白酶缺陷型宿主SMD1168 yps1△表达相应的蛋白水解酶敏感型重组蛋白—人血清白蛋白‑人甲状旁腺激素1‑34融合蛋白,SEQ ID NO:13为该融合蛋白的基因和蛋白质序列。 |
地址 |
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