一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRP)的方法，包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制，其特征在于：具体包括下列工序：A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T-1-GRP；C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；D、蛋白提取和E、蛋白活性鉴定。本发明通过筛选大肠杆菌高效表达菌株，优化培养基，克隆基因构建出GRP基因重组表达质粒pGEX4T-1-GRP，再用阳性质粒对菌种为rosetta的大肠杆菌菌株进行转化，并采用优化的专用培养基LinA培养、缓冲液TKM，筛选出了高效表达菌株，从而提高了烟草中富含甘氨酸RNA结合蛋白的表达效率。本发明具有成本低、操作简单、生产周期短、适于大规模生产、蛋白表达率高、活性强，易于纯化、不易降解的优点。

主权项

一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法，包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲液配制，其特征在于：具体包括下列工序：A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；B、构建重组表达质粒pGEX4T‑1‑GRP；C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达；用阳性pGEX4T‑1‑GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂培养基LinA平板，37℃恒温培养箱培养约15小时至长出单克隆，用牙签挑10个克隆菌株分别做好标记，各克隆菌株的一半分别放入2ml培养基LinA中，于37℃摇约4‑5小时至OD600＝0.5，每管取出200μl作为阴性对照，剩余加终浓度为0.5mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG，于37℃下诱导两小时后所有管取200μl，同两小时前取出的阴性对照一起SDS‑PAGE；选择表达量最好的克隆，从板上挑剩余的一半接种入100ml培养基LinA中，于37℃振摇培养15小时；按1∶100转接入1L培养基LinA中，摇约2小时至OD600＝0.6‑0.8，加入终浓度为0.5mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG于37℃下诱导，2小时后离心收集菌体，并用缓冲液10xA洗一次，沉淀物冷冻于‑80℃冰箱中备用；所述的培养基LinA由8‑12g的胰蛋白胨Trypton、1‑3g的酵母抽提物Yeast extracts、4‑6g的氯化钠NaCl、80‑120ml的缓冲液10xA和1000ml双蒸水配制而成；所述的培养基LinA使用前加入经过滤除菌的浓度0.5％的葡萄糖；所述的缓冲液10xA由380‑420mM的K2HPO4、150‑250mM的KH2PO4、70‑90mM的(NH4)2SO4和16‑20mM的Sodium Citrate配制而成；D、蛋白提取；将诱导表达收集的菌体从‑80℃冰箱取出置于冰上或4℃冰箱中约半小时至溶化；按质量体积比1∶10的比例加入缓冲液TKM，涡旋震荡混匀，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF、溶菌酶、1000倍的二巯基苏糖醇DTT后于冰上磁力搅拌半小时；然后再加入PMSF、DTT，于180HZ超声波间 歇破碎1min，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化10min，于12000rpm离心分离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱体纯化蛋白；所述的缓冲液TKM由8‑12mM的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液Tris‑HCl、40‑60mM氯化钾KCl、8‑12mM的醋酸镁Mg(AC)2配制而成；E、蛋白活性鉴定。