芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法

摘要

本发明公开了一种芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，该方法利用高拷贝穿梭载体，与芽孢外衣蛋白基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因重组后，构建表面展示表达载体，并转化入枯草芽孢杆菌得到重组菌株，该重组菌株的芽孢可催化N-乙酰神经氨酸的合成。与本领域其它方法相比，本发明可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效。此外，利用枯草芽孢杆菌芽孢稳定易于分离和抗逆性的特点，简便了后续分离过程，提高了N-乙酰神经氨酸醛缩酶的稳定性并增加了整个催化过程的安全性。

主权项

芽孢表面展示系统用于N‑乙酰神经氨酸生产的方法，步骤包括高拷贝大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD的构建，高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600的构建，以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600制备孢子悬液作为转化反应的芽孢催化剂，利用所述芽孢催化剂生产N‑乙酰神经氨酸；其特征在于：所述高拷贝大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD构建的出发载体是来源于大肠杆菌的质粒pHP13和来源于枯草芽孢杆菌168的质粒pGDV1，其得到的高拷贝穿梭载体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.7所示；所述高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌WB600的构建是以构建好的高拷贝穿梭载体pHPGD为出发载体，在多克隆位点按顺序插入芽孢外衣蛋白CotG基因和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD‑cotG‑nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotB基因和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD‑cotB‑nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotC基因和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD‑cotC‑nanA，然后分别电转来源于枯草芽孢杆菌168的、有六个蛋白酶trpC2 ΔnprE ΔaprE Δepr Δbpf Δmpr ΔnprB缺失的枯草芽孢杆菌感受态的菌株WB600，经筛选获得；所述以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600制备孢子悬液作为转化反应催化剂的方法为：以体积比1％‑2％的量将重组枯草芽孢杆菌WB600重悬于pH＝8.0、10mM Tris‑HCl溶液中，并按0.1～1.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用1小时，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1‑2遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂；所述利用芽孢催化剂生产N‑乙酰神经氨酸的条件是：反应体系中催化剂N‑乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.1～1.5U，N‑乙酰甘露糖胺浓度为50～500mM，丙酮酸浓度为200～1500mM，磷酸缓冲液浓度40～80mM，反应pH值为7～7.8，反应温度为25～70℃，反应时间为6～40小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30～70％。