一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

摘要

本发明公开了一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法，采用可控双裂解技术制备重组猪胸膜肺炎放线杆菌APP菌影，将巴氏杆菌保护基因导入APP菌影载体，制成猪胸膜肺炎和巴氏杆菌二联基因疫苗。用以预防猪巴氏杆菌病和胸膜肺炎。实现菌影载体的制备及其在重要动物传染病预防中的应用，同时为多联基因疫苗的研究提供方法。动物实验显示该二联疫苗对猪传染性胸膜肺炎和巴氏杆菌病保护率达分别为99％和99.2％。

主权项

一种制备App菌影的方法，其特征在于，包括步骤如下：1)E、SN和E‑15aa linker‑SN基因的扩增根据噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列设计引物：E1：5’‑CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG‑3’(EcoRI)E2：5’‑GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT‑3’(SalI)SN1：5’‑CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT‑3’(EcoRI)SN2：5’‑GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG‑3’(SalI)再设计含15个柔性氨基酸linker的引物，用于将裂解基因E和核酸酶A基因SN串联：E2’：5’‑TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC‑3’SN1’：5’‑GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT‑3’以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，分别采用E1、E2和E1、E2’为上、下引物，扩增裂解基因E，得到两组产物，后者在E基因后带有linker；以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923基因组DNA为模板，分别以SN1、SN2和SN1’、SN2为上、下游引物，扩增基因SN，得到两组产物，后者于SN基因前带有linker；以带有linker的E和SN基因为模板，以E1和SN2为引物，通过降落PCR法，得到双基因串联产物E‑15aa linker‑SN；2)重组表达质粒及双基因裂解体系的构建将获得的E、SN和E‑15aa linker‑SN与pMD‑18T载体连接，转化感受态 E.coli DH5α，抗性平板筛选阳性菌落后，提质粒酶切鉴定，获得重组克隆质粒pMD‑E、pMD‑SN和pMD‑E‑15aa linker‑SN；双酶切pMD‑E、pMD‑E‑15aalinker‑SN和温控表达载体pBV220，经连接、转化、筛选重组子、提质粒酶切鉴定后，分别获得重组表达载体pBV‑E和pBV‑E‑15aa linker‑SN，通过菌体裂解试验，对温控裂解体系功能进行评价；3)E.coli‑App重组穿梭表达载体的构建根据Genbank中λpL/pR‑cI857温控启动子序列及pBV220质粒序列设计温控裂解盒上游引物λpL/pR‑cI857FP，与SN基因下游引物SN2’结合，以pBV‑E‑15aa linker‑SN为模板，对该融合基因进行扩增，引物序列如下：λpL/pR‑cI857FP：5’‑ATA GGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG‑3’(ApaI)SN2’：5’‑CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT‑3’(BamHI)扩增产物与pMD‑18T载体连接，转化、筛选重组子，提质粒酶切鉴定后得到重组克隆载体携带的温控裂解盒；用ApaI和BamHI分别酶切穿梭载体pMC‑Express和温控裂解盒克隆载体，胶回收试剂盒回收目的片段，以T4DNA连接酶将线性化载体与目的片段进行连接，转化感受态细胞，筛选重组子，提质粒酶切鉴定后获得重组穿梭表达载体；4)App重组菌的构建及菌影的制备采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，以pMC‑Express转化App菌为对照，测定温控双基因裂解系统对App菌的裂解特性，并镜检升温前后菌体的形态变化，获得App菌影。