转导iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种转导iASPP-FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建hM HS21/45vav-iASPP-FL质粒，将此质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度。通过显微注射的方法把转基因载体hM HS21/45 vav-iASPP-FL注射入C57小鼠受精卵内。采用分子生物学、实验动物学等方法获得了造血系统特异性高表达iASPP-FL转基因小鼠模型，为进一步阐述正常造血干祖细胞向肿瘤细胞转化的机制研究以及靶向治疗奠定了基础。

主权项

一种转导全长型iASPP‑FL癌基因在造血系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：1)载体构建：自pcDNA3.10‑WT‑iASPP‑FL‑V5中，PCR扩增iASPP‑FL，引入所需的Not I和Sfi I酶切位点：上游引物为5’‑GCAGGCCCGTACGGCCATGGACAGCGAGGCATTC‑3’下划线为引入Sfi I酶切位点下游引物为5’‑CAGCGCGGCCGCCTAGACTTTACTCCTTTG‑3’划线为引入Not I酶切位点反应条件为98℃1min预变性；重复如下循环27次：98℃10s，60℃10s，72℃5min；然后4℃保存，扩增片段长度为2509bp，PCR扩增后加入A尾，电泳定量并进行胶回收纯化，连接入pMD18‑T载体中，转化E.coli DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆提取质粒经Sfi I和Not I双酶切鉴定后，测序正确的克隆，经SfiI和NotI双酶切得到iASPP‑FL片段，胶回收纯化，hM HS21/45vav经Sfi I和Not I双酶切，纯化定量，与自pMD18‑T‑iASPP‑FL载体Sfi I和Not I双酶切纯化所得的iASPP‑FL片段连接，转化DH5α感受态细胞后挑取克隆，Sfi I和Not I双酶切鉴定已插入目的片段，构建hMHS21/45vav‑iASPP‑FL质粒；2)转基因载体的线性化与纯化：将构建hM HS21/45vav‑iASPP‑FL质粒经Hind III酶切后移除载体中的原核表达载体部分，完成线性化后，低电压电泳过夜，切胶回收，纯化，调整核酸浓度，得到纯化的转基因载体hM HS21/45vav‑iASPP‑FL；3)小鼠模型制备：把转基因载体hM HS21/45vav‑iASPP‑FL注射入C57小鼠受精卵内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，自尾部提取DNA使用PCR检测目的基因iASPP FL的整合，得到转导iASPP‑FL癌基因的阳性首建鼠；4)建立iASPP‑FL转基因鼠系：将整合外源目的基因首建鼠与6‑8周龄正常野生型C57BL/6J小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带遗传自父代的外源基因整合情况，获取研究所需阳性子代iASPP‑FL转基因小鼠。