一种快速微量测定糖化酶活力的方法

摘要

本发明提供一种快速微量测定糖化酶活力的方法，取A、B两支EP管，分别加入可溶性淀粉溶液和醋酸缓冲液混均；在B管中加入待测酶液混均反应后，向A、B两管中加NaOH混均后冷却，A管中补加热变性的酶液作为空白对照；另取两只EP管，分别加入去离子水，吸取上述A、B两管溶液分别加入到两只EP管内，加入DNS溶液，沸水浴反应取出，冷却后加入到96孔板内，加去离子水混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据葡萄糖与OD值标准曲线即可计算其还原糖含量。本发明解决了现有糖化酶检测方法存在的检测程序烦琐、耗时较长或需要稀释很高倍数，造成误差较大等缺欠。

主权项

一种快速微量测定糖化酶活力的方法，包括以下步骤：1）96孔板内葡萄糖标准曲线的制备取烘干至恒重的葡萄糖1g，用去离子水溶解，容量瓶定容至100mL，制备10mg/mL葡萄糖储备液；分别将其稀释成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL葡萄糖溶液；取8只EP管，分别加入100μl去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50μl，最后加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中2min, 从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的标准曲线；2）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl和0.05M的 pH4.6醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于（40±0.2）℃温水浴中预热5~10min；在B管中加入待测酶液40μl，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加1M NaOH20μl, 混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管中补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；3）另取两只EP管，分别加入100μl去离子水，吸取上述A、B两管溶液各50μl，分别加入到两只EP管内，并加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min，从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据步骤1）制备的96孔板内葡萄糖与OD值标准曲线计算其还原糖含量；再根据下列公式计算糖化酶活力；糖化酶活力（U/mL）=(B‑A)*2*16.5*N式中，B为总还原糖含量；A为对照管中还原糖含量；B‑A为酶反应生成还原糖含量；2为反应30min，换算成1h酶活力系数；16.5为换算成1mL的反应体系；N为稀释倍数。