利用EcoRII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法

摘要

本发明公开了一种利用EcoRII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法，是在确定新筛选出的基因盒阵列时，先采用限制性内切酶EcoRII对其进行酶切，与已构建的EcoRII酶切图谱库中的酶切图谱比对，来确定新筛选基因盒阵列的新颖程度，若库中无与其匹配图谱，则再选择连接、转化、测序分析，实现了有目的的测序。本发明方法既准确快速又经济节约，也便于信息共享。较适用于医院、检疫、测报、防治等有关部门在抗生素滥用还没有得到很好遏制的情况下，实现有效地监测和防治含整合子耐药细菌通过水平转移传播造成的耐药细菌的爆发性流行。

主权项

1.一种利用EcoRII酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法，步骤是：(1)取医院周围的废水样品，以0.22μm孔径无菌滤膜过滤富集菌体，将膜转接到LB液体培养基中过夜培养，梯度稀释菌液涂布于含有100mgl^-1氨苄西林，30mgl^-1卡那霉素，30mgl^-1四环素，30mgl^-1头孢他啶，10mgl^-1链霉素，30mgl^-1氯霉素，300mgl^-1磺胺异恶挫，200mgl^-1磷霉素，5mgl^-1加替沙星或30mgl^-1甲氧苄啶的抗性平板上，常规培养，然后依据菌落鉴定手册规定的指标，挑取单克隆菌落，继续培养，获得耐药细菌；(2)以CTAB法分别提取获得的耐药细菌的基因组DNA；(3)分别以筛得的耐药细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测所述耐药菌中是否含有1型整合酶，以此确定所述菌是否为含1型整合子的耐药细菌；其中上述PCR所用扩增引物为：上游引物intI1-F：5’-GTTCGGTCAAGGTTCTGG-3’&下游引物intI1-R：5’-CGTAGAGACGTCGGAATG-3’；(4)选择步骤(3)确定的含1型整合子的阳性菌株，再分别以其基因组DNA为模板，进行PCR扩增，取扩增后产物采用琼脂糖凝胶电泳检测1型整合子的阳性菌株中是否携带基因盒阵列；其中所述的PCR扩增引物为：上游引物hep58：5’-TCATGGCTTGTTATGACTGT-3’&下游引物hep59：5’-GTAGGGCTTATTATGCACGC-3’；(5)选择携带基因盒阵列的阳性菌株，切胶回收其携带的基因盒阵列DNA片段，以常规方法与pMD19-T SimpleVector连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；(6)依据所选阳性菌株整合的基因盒阵列的测序结果，选定限制性内切酶EcoRII，对所述阳性菌株中整合的非重复基因盒阵列DNA片段采用常规酶切体系于37℃消化3～6小时，然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，构建出EcoRII的酶切图谱库如下：(7)利用构建的限制性内切酶EcoRII的酶切图谱库检测待测耐药菌整合子中基因盒阵列，步骤是：取筛选得到的待测耐药细菌，依据步骤(2)所述方法提取细菌基因组DNA，依据步骤(3)所述方法检测其是否为含1型整合子的耐药细菌，依据步骤(4)所述方法检测确定为1型整合子的阳性菌株中是否携带基因盒阵列，选确定为携带基因盒阵列的扩增后产物用限制性内切酶EcoRII以常规酶切体系于37℃消化3～6小时，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，得待测耐药菌的酶切图谱，然后将其与步骤6构建的EcoRII的酶切图谱库比对，当a：若测得的待测耐药菌基因盒阵列长度及EcoRII酶切图谱与图谱库中所列某一基因盒阵列信息相同，则该待测耐药菌携带的基因盒阵列即可依此定性，无需测序鉴定；b：若测得的待测耐药菌基因盒阵列长度及EcoRII酶切图谱与图谱库中所列任一基因盒阵列信息不相同，则确定该待测耐药菌携带的基因盒阵列非上述酶切图谱库所报道的基因盒阵列，需依据步骤(5)所述方法连接、转化、测序。