高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法

摘要

本发明涉及一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法，是将地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因经突变后(Leu134→Arg和Ser320→Ala)获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因，通过构建打靶载体，利用同源重组的方法，将其整合到出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA中，得到了地衣芽孢杆菌突变株，实现高温耐酸性α-淀粉酶的同源高效表达。本发明中的突变株所产α-淀粉酶在本身耐高温的基础上，酸稳定性也有了明显地提高，为我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业提供了更好的工艺条件，降低了成本，节省了能源和工业用粮，满足了一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求。

主权项

一种产高温耐酸性α‑淀粉酶的突变株的构建方法，其特征在于：所述突变株是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温α‑淀粉酶基因经体外Leu134→Arg和Ser320→Ala突变后所获得的高温耐酸性α‑淀粉酶基因取代原始耐高温α‑淀粉酶基因后得到的突变株；构建方法包括如下步骤：(1).构建打靶载体pUC‑amy1‑amy2‑Kmr：以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，各设计两对特异的PCR引物，该两对特异的PCR引物的序列为：序列9、序列10和序列11、序列12：，扩增耐高温α‑淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到两个同源性核苷酸片段，将上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向连接入载体中，构建得到打靶载体pUC‑amy1‑amy2‑Kmr；(2).构建打靶载体pUC‑amyd：以地衣芽孢杆菌耐高温耐酸性α‑淀粉酶基因为模板，该基因编码的氨基酸序列为：序列4，设计特异的PCR引物，该引物序列为：序列9、序列12，扩增高温耐酸性α‑淀粉酶基因，将该片段连入载体中，构建得到打靶载体pUC‑amyd；(3).获得地衣芽孢杆菌耐高温α‑淀粉酶基因缺失株：利用打靶载体pUC‑amy1‑amy2‑Kmr化地衣芽孢杆菌原始出发菌株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，卡那抗性基因取代基因组DNA中部分耐高温α‑淀粉酶基因，获得地衣芽孢杆菌耐高温α‑淀粉酶基因缺失株；(4).获得高温耐酸性α‑淀粉酶基因突变株：利用打靶载体pUC‑amyd转化地衣芽孢杆菌耐高温α‑淀粉酶基因缺失株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，高温耐酸性α‑淀粉酶基因带有两个突变位点的部分基因取代缺失株基因组中卡那抗性基因，获得地衣芽孢杆菌高温耐酸性α‑淀粉酶基因突变株；所述步骤(1)、(2)中连接基因片段的载体为pUC19；所述步骤(1)、(3)、(4)中卡那抗性基因来自于枯草芽孢杆菌pWB980质粒，大小为1112bp；所述的地衣芽孢杆菌和出发菌株地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏，保藏号：10181。