一种体外进化β-葡聚糖酶的方法

摘要

定向进化技术是由美国工程院院士、加州理工学院化工系教授FrancesH.Arnold于90年代初期开发出来的一项蛋白质工程技术。它是基因工程、蛋白质结构和计算机技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、耐热性好、pH稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的主要问题。本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。

主权项

1.一种基于易错PCR技术对淀粉液化芽孢杆菌源β-葡聚糖酶进行体外分子进化提高其热稳定性的方法，其特征步骤为：(1)β-葡聚糖酶基因的易错PCR扩增在易错PCR中以引物PAG1-F：5’-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3’(划线区域为BamH I酶切位点)和PAG1-R：5’-GTAGTCATCCGATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3’(划线区域为Xho I酶切位点)分别作为正向和反向引物，以β-葡聚糖酶基因为模板进行扩增。PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；4℃保温。(2)易错PCR产物的回收纯化1％琼脂糖凝胶电泳检测后利用胶回收试剂盒回收PCR产物，-20℃保存。(3)易错PCR产物及质粒pET28a(+)的双酶切。(4)易错PCR产物及质粒pET28a(+)连接构建重组质粒库。表1易错PCR反应方案(5)含突变基因文库的构建A.从37℃培养16-20h的新鲜平板中挑选一个单菌落(直径2-3mm)转到一个含有10mL LB培养基的三角瓶中。于37℃剧烈振荡培养约3h(旋转摇床，转速200r/min)，每隔20-30min测量OD₆₀₀值来监测培养物的生长状况。当OD₆₀₀约为0.4时收获细胞。B.在无菌条件下，取1.8mL菌液转至冰预冷的2mL的聚丙烯离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。C.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。无菌生理盐水洗涤菌体一次。D.以0.9mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，冰上放置30min，5,000r/min离心10min。E.每50mL初始培养液用30mL冰预冷的0.1mol/L MgCl₂-CaCl₂重悬沉淀，两只离心管合并成一只，放置于冰上。F.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。加入120μL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞。G.每份感受态细胞加入连接产物5μL，轻轻旋转，混匀，冰上静置30min。H.离心管放至42℃的循环水浴中90s，不要摇动。快速将离心管移至冰浴中，冷却细胞2min。I.加入700μLSOC培养基，转移到37℃水浴5min，然后转移到37℃摇床，50r/min温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标志基因。J.将适量体积的已转化的感受态细胞涂布含有相应抗生素的SOB平板上。将平板置于室温直至菌液被全部吸收。倒置平板，37℃培养12-16h，可见相应菌落。(6)突变文库的高通量筛选