蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法

摘要

一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物、蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物。本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提供技术保障。

主权项

一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，其特征在于：a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；b、引物设计与合成：蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物：SBV15’‑ACC AAC CGATTC CTC AGTAG‑3’SBV25’‑CCT TGGAAC TCT GCT GTG TA‑3’蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物：SBV311F    5’‑AAGTTGGAGGCGCGTAATTG‑3’SBV380R    5’‑AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG‑3’SBV331T    5’‑FAM‑CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA‑TAMRA‑3’；c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；(3)4℃12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；(4)4℃12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；d、将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃5min，4℃5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。