主权项 |
一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法,其特征在于,包括以下步骤:a)分别准备空白管、标准管和待测样品管;首先向空白管、标准管和待测样品加入底物溶液,所述底物溶液为5mg/ml~10 mg/ml琥珀酰明胶;接着向空白管中加入样品稀释液,向标准管中加入标准品,向待测样品管中加入待测样品,所述样品稀释液为体积百分比为40mmol/l~60 mmol/l Tris缓冲液、5mmol/l~15mmol/l CaCl2、10μmol/l ~20μmol/l ZnCl2以及质量百分数为0.05%~0.1% 月桂醇聚氧乙烯醚混合而成,所述标准品为已知浓度的Ⅳ型胶原酶;最后向标准管和待测样品管中加入样品稀释液,在35oC~45oC水浴反应30~120分钟;b)在空白管、标准管和待测样品管中加入终止液终止酶切反应,再加入检测溶液A和检测溶液B,最后加入检测稀释液,在35oC~45oC水浴下显色反应30~60分钟,使其显色反应充分进行,所述终止液为质量百分数为0.05%~0.2% HCL, 检测溶液A为0.1M~0.5M NaOH,检测溶液B为质量百分数为0.01%~0.05% 三硝基苯磺酸,检测稀释液为双蒸水;c)各管冷却至室温后,取各管溶液至酶标板中,用酶标仪测定吸光度;d)以标准物的浓度为横坐标,测定出的吸光度值为纵坐标,绘制出标准曲线,根据待测样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的待测样品的Ⅳ型胶原酶含量;或者用标准物的浓度与吸光度值算出标准曲线的方程,将待测样品的吸光度值代入方程,计算出待测样品的Ⅳ型胶原酶含量。 |