测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法

摘要

本发明公开了测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是采用新颖的半抗原修饰方法，合成盐酸林可霉素的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过免疫动物获得兔抗盐酸林可霉素的多克隆抗体。抗体用于盐酸林可霉素的免疫分析，标准曲线的浓度范围为1～1000ng/mL，IC50为23.7～29.3ng/mL；抗体与盐酸克林霉素的交叉反应率为18.9％，与其它7种常用抗生素或激素几乎没有交叉反应。6种市售食品加标后用0.01mol/L HCL萃取，萃取液经适当稀释用ELISA测定，加标回收率为76.6～117.6％，相对标准偏差为1.7～34.6％。用HPLC和ELISA对7种加标样品进行分析，两种方法相关性较好(R2＝0.9756，n＝7)。本发明建立的ELISA可靠，灵敏度高，特异性强，可用于食品中盐酸林可霉素含量检测。

主权项

1.测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)盐酸林可霉素修饰物的制备步骤1：将3～5g盐酸林可霉素与5～8mL对甲氧基苯甲醛溶于15～20mLN，N-二甲基甲酰胺中，以苯作为带水剂，在温度96～106℃下反应，在苯不断被蒸走后得到粗产物，再经过NaHCO₃中和至中性，二氯甲烷萃取，活性碳脱色以及乙醚-正己烷结晶后得到第一步产物2.5g，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤2：将0.5～0.8g步骤1产物、1～2mL三乙胺和1.5～1.8g三苯氯甲烷溶解在5～8mL丙酮中，以CaCl₂为干燥剂回流反应24小时，将反应液冷却到50℃，加入0.5～1.5g硅胶，混合物搅拌10分钟，用丙酮热过滤，滤液用环己烷-正己烷结晶得到粗产物，粗产物溶于丙酮中快速经过硅胶柱，收集流出液，加热回流，用50～70mL 55℃的水重结晶得到略黄有光泽的固体颗粒，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤3：将步骤2产物0.2～0.5g和0.1～0.18g丁二酸酐溶于10～20mL新蒸吡啶中，在氮气保护下，室温反应24小时，在温度45℃真空旋干得到黄色油状物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/L HCL及纯水洗涤，加入无水Na₂SO₄干燥过夜，真空旋干得白色固体，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤4：将步骤3产物0.1～0.18g加入3～5mL80％乙酸溶液中，在温度90～100℃加热回流20～30分钟，充分冷却，析出白色固体，过滤，滤液真空旋干得油状物，用苯反复洗涤，旋干得到最终产物，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤1-4的反应如下：(2)免疫原和包被抗原的制备将30～50mg盐酸林可霉素衍生物、15～18mg二环己基碳二亚胺和8～10mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于400～600μL的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜，将混合物离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌反应24小时，离心分离，取上层清液，透析数天，获得林可霉素-蛋白质溶液，冷冻干燥，于温度-20℃保存待用，其中，LIN-OVA为免疫原，LIN-BSA为包被抗原；(3)盐酸林可霉素多克隆抗体的制备用免疫原LIN-OVA免疫两只兔子：将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于温度-20℃保存；(4)建立测定盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸林可霉素含量的ELISA；(5)ELISA对加标样品中盐酸林可霉素含量的测定随机选择了6种食品：牛奶I，牛奶II，猪肝I，猪肝II，鸡肉I，鸡肉II，经ELISA检测，均没有检出林可霉素，为阴性样品，对所选样品进行加标实验，猪肝及鸡肉样品需切碎匀浆，牛奶样品可直接用于加标，称取1～5g，加入不同浓度盐酸林可霉素标准溶液，震荡20分钟，4℃静止过夜，加入0.01mol/L HCL溶液，水浴振荡半小时，超声20分钟，离心，取上层清液，用2mol/L NaOH溶液调节pH值到6.0左右，离心，上清液用超纯水稀释20～50倍后ELISA直接测定，回收率在76.6-117.6％，相对标准偏差为1.7-34.6％，说明该ELISA方法的准确性和精密度都较好；(6)ELISA和HPLC的比较盐酸林可霉素的HPLC条件为：Hypersil Gold柱，柱温为室温，流动相为用H₃PO₄调节pH至6.0的0.01mol/L硼砂溶液∶甲醇＝80∶∶20，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长215nm，盐酸林可霉素标准溶液的浓度分别为：1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，7种加标样品，即牛奶I，加标浓度5μg/mL和10μg/mL；牛奶II，加标浓度20μg/mL；猪肝I，加标浓度40μg/g；猪肝II，加标浓度50μg/g；鸡肉I，加标浓度80μg/g；鸡肉II，加标浓度100μg/g，加标样品用0.1mol/L盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝1.022x-0.9995，相关系数为0.9756，n＝7，说明二者的相关性很好。