主权项 |
一种细菌质粒DNA提取的方法,其特征在于:1)细菌的培养:将挑取的细菌单菌落在细菌常用液体培养基中,25-30℃振摇过夜培养;所述细菌常用液体培养基的成分为:葡萄糖1.0g,酵母膏1.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,Na2CO3 0.1g,CaCl2·2H2O 0.01g,MnSO4·H2O 0.02g,FeSO4·7H2O 0.005g,NH4NO3 1.0g,KH2PO4 0.4g,Na2HPO4 0.6g,加蒸馏水至1L,pH7.2-7.5;2)菌体的收集、裂解:当细菌为革兰氏染色阴性菌时,取1.5-2.0mL步骤1)得到的培养16-24小时的菌液,并在10000-12000rpm下离心30-60秒,收集菌体;用1-1.5mL STE溶液洗涤两次,10000rpm离心30秒;而后在细菌沉淀中加入100-300μL溶液I,再加入200-600μL溶液II,冰浴3-5分钟,得裂解菌液;当为革兰氏染色阳性菌分别培养时,取3.0-4.0mL步骤1)得到的培养10-16小时的菌液,并在8000-10000rpm下离心60-90秒,收集菌体;用2.0-3.0mL STE溶液洗涤两次,10000rpm离心30秒;而后在细菌沉淀中加入100-200μL溶液I和50-100μL溶菌酶,37℃水浴30-60分钟,然后再加入200-600μL溶液II,冰浴3-5分钟,得裂解菌液;STE溶液的成分为10mmol/L Tris·Cl,pH8.0,10mmol/L NaCl和1mmol/L EDTA,pH8.0;3)质粒DNA的复性、与染色体DNA分离:在步骤2)中得到的裂解菌液内加入150-400μL溶液III,冰浴15-20分钟,4℃下以12000rpm离心10分钟,取上清;并在上清液中加与其等体积的异丙醇,室温放置5分钟,4℃下再以12000rpm离心5分钟,取其沉淀待用;4)质粒DNA的沉淀:步骤3)得到的沉淀用100-400μL无菌重蒸水溶解,并加入溶解沉淀的无菌水的1/2体积的7.5mol·L-1 NH4Ac和5mol·L-1 LiCl,冰浴3-5分钟,4℃下以12000rpm离心5分钟,取上清;并在上清液中加与其等体积的异丙醇,室温放置40分钟,沉淀即为质粒DNA;其中:溶液I为50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris·Cl,pH8.0和10mmol/L EDTA,pH8.0;溶液II为0.2mol/L NaOH和1%SDS;溶液III为溶液中含钾的浓度为3-5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根,pH4.8;NH4Ac和LiCl之间的摩尔比例是1∶1。 |