两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法

摘要

本发明公开了属于人阴道上皮细胞培养技术范围的一种培养基联合序贯培养细胞的方法。即用无血清培养基+含血清培养基的序贯培养，从而可以迅速使阴道上皮原代细胞大量增殖，传代成功率在80％左右。

主权项

1.一种两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，其特征在于：所述对人阴道上皮细胞的培养过程如下：(1)阴道上皮细胞的原代培养1.1取材：同时满足以下3条：1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织或子宫肌瘤、子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；2)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；3)术后病理均为良性疾病；1.2从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有庆大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液的无血清培养基无菌小瓶内；其中三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比为1∶100；1.3消毒：用步骤1.2的加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍；1.4分离：用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染；1.5接种：将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内；1.6培养：将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基，倒置3小时，在37℃，体积比浓度为5％的CO2培养箱中培养；其中三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比为1∶100；1.7换液：3天后用步骤1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次；1.8培养2周左右取出组织块，往无血清培养基中加入体积比浓度10％胎牛血清继续培养约2周左右，原代细胞数量大大增加；其胎牛血清为美国GIBCO公司出品；(2)阴道上皮细胞的传代培养2.1细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代；2.2吸除或倒掉瓶内旧培养液；2.3向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉；2.4向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸等量混合的消化液；上述胰蛋白酶和乙二胺四乙酸为Sigma公司产品；2.5 37℃消化3-6分钟；2.6倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管，用于终止消化的含10％胎牛血清的培养液为美国Hyclone公司产品DMEM/F-12；2.7800rpm离心3分钟；2.8弃去上清，加入新鲜的含抗生素的无血清培养基，吹打成单细胞悬液，取一滴在血球计数板计数，其中抗生素为青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，二者体积比为1∶1；2.9按1∶2或1∶3进行传代；2.10细胞传代后次日用上述步骤2.8的无血清培养基进行换液，体外可传7-9代，传代成功率高；上述步骤中所指的无血清培养基为美国GIBCO公司生产，产品编号为17005-042的“Keratinocyte-SFM”即“K-SFM”。