蛇毒细胞毒素及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种蛇毒细胞毒素及其制备方法与应用。本发明所公开的制备蛇毒细胞毒素的方法包括如下步骤：(1)将蛇毒溶液进行离子交换层析，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上的第一吸收峰和第二吸收峰之间的流出液；(2)将步骤(1)得到的流出液进行排阻层析，以水作为流动相，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上第二吸收峰，得到蛇毒细胞毒素。本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素能够明显诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡，当蛇毒细胞毒素浓度为0.01mg/ml时，其诱导Hep-2细胞凋亡的能力强于浓度为100μg/ml的平阳霉素；而且异常毒性实验证明该细胞毒素的副作用轻。本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素可以作为一种抗癌症药物，使生物抗癌药成为现实。

主权项

1、一种制备蛇毒细胞毒素的方法，包括如下步骤：(1)蛇毒溶解：将8g锯鳞蝰蛇蛇毒冻干粉溶于100ml pH8.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中；(2)除杂蛋白：向步骤(1)获得的蛇毒溶液中加入6ml饱和硫酸铵溶液，混合后在室温条件下放置1小时，3000rpm离心10分钟，弃去沉淀，保留上清溶液；(3)透析除盐：将步骤(2)获得的全部上清液封闭在截留14000D分子量的透析袋中，然后将透析袋放入蒸馏水中透析15小时，每3小时换水一次，蒸馏水的体积1200ml，透析后所得到的透析液为180ml；(4)离子交换层析：用pH8.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-50层析柱15小时，流速为1.0ml/min；将步骤(3)获得的透析得到的透析液移到平衡后的DEAE-Sephadex A-50层析柱，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH8.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液50ml；以pH8.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液为起始液，以pH8.2、0.05mol/L的含0.5mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液为终止液进行氯化钠线性梯度洗脱，所用洗脱液共4000ml，洗脱液的流速为0.8-1.0ml/min，即氯化钠的浓度的变化速度为1×10-4mol/L/min-1.25×10-4mol/L/min；用自动馏分收集器收集，每管15ml，通过紫外分光光度计检测层析液吸光度，检测波长为280nm，制作点-吸光度曲线，收集第一吸收峰和第二吸收峰之间的部分，即第16-29管流出液，收集的流出液为210ml；(5)排阻层析：将步骤(4)获得的210ml流出液进行排阻层析，用BIO-GEL-P-60凝胶层析分离，层析柱长150cm，直径4.5cm，胶床高度不低于120cm，以纯化水作为流动相，流速40ml/h；用自动馏分收集器收集层析液，15ml/管，通过紫外分光光度计监测层析液吸光度，检测波长为280nm；制作点-吸光度曲线，收集吸光度曲线上的第二吸收峰，即第26-34管流出液，收集流出液135ml，得到蛇毒细胞毒素。