核盘菌群体中抗药性基因频率的高通量实时检测技术

摘要

本发明属于核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)群体中抗药性基因频率的实时检测方法，可用于引起油菜等作物菌核病的核盘菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂抗药性监测和流行预警。该检测方法共分3个主要步骤，第一步：分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA；第二步：运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物，进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线；第三步：待测样品分别运用上述两种特异性引物进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在核盘菌总量中的比例。采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术可以高通量、快速、准确定量测出田间抗药性核盘菌的数量及其在病原群体中的比例，具有高通量的特点。比常规的生物测定和普通的PCR检测抗药性菌株省时、节本、快速。直接从田间采集回来的菌核、病斑和孢子中提取基因组DNA到实时定量-PCR整个检测过程只需6h，检测准确率达96％以上。

主权项

1、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)群体中抗药性基因频率的实时检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术检测核盘菌群体中存在的对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性基因频率。一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，共分三步第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。第二步：运用抗药性菌株和核盘菌菌株的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和核盘菌菌株检测的标准曲线。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序：(1)核盘菌总量检测的标准曲线反应体系：dH₂O(灭菌蒸馏水)                             9μLPremix Ex Taq^TM(2×)                     12.5μLSclSF(10μM)                                  0.25μLSclAF(10μM)                                  0.25μLROX Reference Dye(50×)                      0.5μLDNA模板                                      2.0μI总体积                                       25μL扩增条件：预变性：95℃                         10s             ↓变性：95℃                           5s退火：55.8℃                         31s40个循环             ↓延伸：72℃                           5minDissociation protocol                58℃(2)抗性核盘菌量的标准曲线反应体系：dH₂O(灭菌蒸馏水)                          9μLPremix Ex Taq^TM(2×)                 12.5μLRFP4(10μM)                               0.25μLRRP(10μM)                                0.25μLROX Reference Dye(50×)                  0.5μLDNA模板                    2.0μL总体积                     25μL扩增条件：预变性：95℃                     10s                 ↓变性：95℃                       5s退火：62℃                       33s40个循环                 ↓延伸：72℃                       5minDissociation protocol            58℃第三步：待测样品分别运用上述两种特异性引物进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在核盘菌总量中的比例。