在真核细胞中同源重组的改进的方法

摘要

本发明公开了构建真核细胞的方法，所述真核细胞染色体DNA序列中的靶序列被置换为想要的置换序列，所述方法包括：修饰对NHR具有偏好的亲本真核细胞，提供与亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞；提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置换序列，该置换序列5’和3’侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和与之可操作地连接的、在真核细胞中有功能的调节序列；用DNA分子转化经修饰的真核细胞；培养细胞，获得经转化的后代细胞，所述后代细胞染色体中插入了所述DNA分子，通过表达选择标记物，取消选定其中DNA分子通过非同源重组事件被插入染色体中的后代细胞；和获得其中染色体DNA序列中的靶序列被想要的置换序列置换的细胞。

主权项

1. 构建真核细胞的方法，所述真核细胞染色体DNA序列中的靶序列被置换为想要的置换序列，所述方法包括：修饰对NHR具有偏好的亲本真核细胞，提供与所述亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞，提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置换序列，该置换序列5’和3’侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和与之可操作地连接的、在真核细胞中有功能的调节序列；用所述DNA分子转化所述经修饰的真核细胞；培养所述细胞，获得经转化的后代细胞，所述后代细胞染色体中插入了所述DNA分子，通过表达所述第二标记物，取消选定其中所述DNA分子通过非同源重组事件被插入所述染色体中的后代细胞；和获得其中所述染色体DNA序列中的所述靶序列被所述想要的置换序列置换的细胞。